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Cu/Zn SOD蛋白在布鲁菌S19疫苗株中的过表达及鉴定被引量：1: 2019年; 以Cu/Zn SOD为目的基因,通过基因工程技术分别构建了组成型过表达系统pBBR-trc-sod和诱导型过表达系统pBBR-lacPtrc-sod,在布鲁菌S19疫苗株中进行了Cu/Zn SOD的过表达。同时,以大肠杆菌为宿主表达纯化的重组Cu/Zn SOD蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,对2种过表达系统中Cu/Zn SOD蛋白的表达量进行分析。结果显示,诱导型Cu/Zn SOD过表达系统的表达量更高,且能与所制备的多抗发生特异性反应。结果表明,构建的过表达系统能够实现Cu/Zn SOD蛋白在布鲁菌S19疫苗株中过表达;同时,该试验也提示我们这种表达系统可应用于布鲁菌S19疫苗的抗原改造。; 邓雨明段开放侯欢欢张燕彭其胜; 关键词：布鲁菌铜锌超氧化物歧化酶

表达锌指蛋白A20的巨噬细胞J774A.1模型的构建被引量：1: 2014年; 为了研究布鲁菌感染机体后锌指蛋白A20调节天然免疫的机制,我们尝试构建A20表达的巨噬细胞模型。通过分子生物学手段构建表达A20的慢病毒;Western blot检测A20的表达;以内毒素(LPS)刺激细胞,Western blot检测IκB-α降解变化且ELISA检测炎性细胞因子TNF-α及IL-6的水平来判定A20表达细胞模型是否成功。限制性内切酶酶切鉴定、DNA测序及慢病毒包装试验表明A20重组慢病毒构建成功;Western blot证实感染J774A.1后A20蛋白表达明显增加;A20表达的J774A.1受到LPS刺激后IκB-α未发生降解,TNF-α及IL-6水平明显低于空载体及空白对照组(P<0.01)。结果表明,本研究成功构建了A20表达的巨噬细胞模型。; 赵玉玺崔桂梅潘垒昌魏盼徐晓晗彭其胜; 关键词：巨噬细胞布鲁菌

低浓度甲醛对多肽和蛋白化学修饰的质谱研究被引量：6: 2016年; 采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)和纳升电喷雾四极杆飞行时间串联质谱(Nano-ESI-QTOF MS)技术,以标准肽段和流感病毒基质蛋白酶切肽段为模型,研究了甲醛对蛋白质和多肽主链的修饰作用。采用与实际病毒灭活过程一致的实验条件(4℃,0.025%(V/V)福尔马林(37%(w/w)甲醛溶液)处理72 h),进行甲醛与多肽的化学反应。结果表明,在实验条件下,甲醛能与标准肽段N端的氨基反应生成羟甲基加合物,再发生缩合反应生成亚胺,形成+12 Da的产物。此外,甲醛还能与标准肽段中的精氨酸、赖氨酸的侧链发生反应,生成+12 Da的反应产物。对流感病毒基质蛋白的酶切肽段与甲醛的反应的质谱分析结果显示,多数的肽段都生成了+24 Da的产物,质量的增加来源于肽段N端氨基(+12 Da)和C端精氨酸或赖氨酸的侧链(+12 Da)的贡献。此外,还观察到有一个漏切位点的肽段生成了+36 Da的产物。本研究结果表明,在实验条件下,低浓度甲醛主要与肽段和蛋白的N端氨基,以及精氨酸和赖氨酸侧链发生反应。本研究为分析低浓度甲醛与蛋白质的反应产物提供了有效的质谱分析方法和解谱依据。; 王子健杨静波李光谱孙宁宁孙万春彭其胜刘宁; 关键词：甲醛多肽基质蛋白化学修饰质谱

A型流感病毒血凝素蛋白S-棕榈酰化修饰的质谱分析被引量：2: 2016年; 蛋白质S-棕榈酰化修饰是指棕榈酸分子通过硫酯键共价结合在蛋白质分子的半胱氨酸(S)的巯基侧链上,是蛋白质脂类修饰的重要形式之一,在细胞信号转导、代谢等过程中起着重要作用。本实验首先利用酰基-生物素置换反应,将A型流感病毒血凝素蛋白上的S-棕榈酸分子转换为含有生物素(Biotin)分子的标签。生物素标记蛋白经特异性富集、电泳分离纯化后,进行胶内水解。再利用质谱技术对水解混合物进行分析。结果表明,经酰基-生物素置换方法处理A型流感病毒裂解产物后,蛋白质耦联生物素的浓度(羟胺处理,+Hydroxylamine)与空白对照组(未加羟胺处理,-Hydroxylamine)的比值大于3;对经富集后的流感病毒血凝素蛋白进行了质谱分析,鉴定了A型的两个S-棕榈酰化修饰位点,分别位于蛋白羧基末端的Cys_(562)和Cys_(565)。本研究为大规模研究S-棕榈酰化修饰蛋白提供了一种特异、有效的分析方法。; 王子健高祥杨静波孙万春吴东林彭其胜刘宁; 关键词：流感病毒血凝素蛋白

布鲁菌DnaK蛋白抑制宿主细胞凋亡被引量：2: 2018年; 布鲁菌病是一种典型的人兽共患细菌病,胞内寄生是其感染宿主、并难以治疗的主要原因。目前有关布鲁菌胞内寄生的机制尚未清晰。在本试验中,通过克隆布鲁菌DnaK基因到表达载体pQE-80L,分离纯化His-DnaK融合蛋白,探讨DnaK蛋白调节宿主细胞凋亡的功能。试验表明,第一,His-DnaK处理的巨噬细胞Caspase3剪切被抑制;第二,His-DnaK处理的巨噬细胞TUNEL染色显著降低;第三,布鲁菌DnaK蛋白能抑制宿主细胞凋亡。这将为进一步阐明布鲁菌胞内寄生的分子机制奠定基础。; 段开放邓雨明崔桂梅彭其胜; 关键词：布鲁菌 DNAK 细胞凋亡

Cu/Zn SOD蛋白调控布鲁氏菌胞内生存机制的初步研究: 布鲁氏菌（Brucella,简称布菌）作为一种革兰氏阴性的兼性胞内寄生菌,其宿主分布范围较广,包括奶牛、山羊、绵羊、狗、猪等多种动物。由布菌引发的布鲁氏菌病（Brucellosis,简称布病）在动物当中会引起流产、早产、...; 邓雨明; 关键词：布鲁氏菌; 文献传递

运用CRISPR/Cas9系统编辑细菌基因的研究进展被引量：2: 2018年; CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）／Cas9（CRISPR—associated proteins9）系统来源于细菌的适应性免疫防御系统，能通过RNA指导的Cas9核酸酶特异性剪切靶标基因。相比于细菌同源重组编辑系统，CRISPR／Cas9系统在细菌的基因编辑中已展现出独特的优势：操作简便、较高的编辑效率、特异性、可以同时编辑多个靶基因或删除基因簇片段且不对基因组产生任何“伤疤”。虽然这种操作系统还没有达到在真核生物中的成熟应用程度，但目前CRISPR／Cas9系统在编辑细菌基因上已取得了一些重要进展，现将对这些进展进行总结与分析。; 段开放邓雨明彭其胜; 关键词：细菌

与Rab2互作布鲁菌株效应蛋白HSP70的鉴定被引量：4: 2014年; 以Rab2作为诱饵钓取布鲁菌效应蛋白,通过RT-PCR获得鼠Rab2基因,利用基因克隆方法构建表达载体pGEX-4T-1-Rab2及其2个突变体pGEX-4T-1-Rab2[N119I]和pGEX-4T-1-Rab2[Q65L];然后IPTG诱导GST-Rab2、GST-Rab2[N119I]和GST-Rab2[Q65L]融合蛋白的表达,使用琼脂糖亲和介质分离纯化融合蛋白;最后将纯化的融合蛋白与超声破碎的野生布鲁菌或Δvirb2缺失布鲁菌株上清互作,利用SDS-PAGE电泳和银染确定差异蛋白,质谱分析差异蛋白。结果表明:所鉴定出的布鲁菌株效应蛋白为热休克蛋白HSP70。这为未来研究HSP70如何调节布鲁菌胞内寄生奠定基础。; 崔桂梅魏盼赵玉玺潘垒昌徐晓晗彭其胜; 关键词：布鲁菌 HSP70

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国家自然科学基金(31372409)