国家自然科学基金(30871370)
- 作品数：6 被引量：15H指数：3
- 相关作者：周冬生杨瑞馥徐国昌杨雷毛秉豫更多>>
- 相关机构：军事医学科学院南阳理工学院重庆医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划“十一五”国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 副溶血弧菌VPA1405多克隆抗体制备及应用被引量：3
- 2013年
- 目的建立副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的Western印迹方法。方法将VPA1405基因克隆到pET-28a(+)载体,转入大肠杆菌BL21中进行不可溶性表达,在变性条件下纯化得到VPA1405蛋白,制备的包涵体溶液直接免疫兔得到多克隆抗体,进而利用Western印迹检测VPA1405蛋白在野生株(WT)和opaR基因敲除株(ΔopaR)中表达水平的差异。结果成功表达纯化了6个与生物膜相关基因的蛋白;Western印迹结果显示OpaR调控子对VPA1405基因的表达呈正调控,这与表型实验结果相符。结论成功建立了VP的Western印迹实验平台,该平台可用于后续VP生物膜相关基因的调控研究。
- 闫小娟张义全王丽刘梦颖杨世亚杨瑞馥周冬生邱景富
- 关键词：副溶血弧菌生物膜WESTERN印迹
- 低盐刺激下副溶血弧菌基因转录表达分析
- 2011年
- 目的:应用全基因组DNA芯片技术分析低盐冷刺激作用下副溶血弧菌基因的转录表达变化。方法:分别采用"低盐持续刺激培养(continuous growth,CTG)"和"中间转入低盐环境培养(shift growth,STG)"。CTG和STG下,分别采用含NaCl浓度为2%和0.66%的MV-5培养基孵育副溶血弧菌,收集菌体,提取RNA,应用全基因组DNA芯片分别比较两个不同的转录表达谱基因变化特点,分析其作用规律。同时,应用实时定量逆转录多聚酶联反应对芯片结果进行验证。结果:和对照组相比,STG实验中,共有205个基因的转录表达发生显著性变化,上调的基因占优势地位;CTG实验中,总计有298个基因的转录表达发生显著性变化,上、下调的基因总体基本趋于平衡状态,没有明显差异。实时定量逆转录多聚酶联反应结果证实其和芯片数据结果有很强的相关性。结论:在低盐这一"胁迫环境"下,副溶血弧菌利用其存在的独特而精细的应对机制,能够顽强的生存下来并繁衍生殖,这一过程中,节能调节处于调控的核心地位。
- 杨雷裴林国赵清超徐国昌毛秉豫
- 关键词：副溶血弧菌DNA芯片转录调控氯化钠
- 冷刺激下副溶血弧菌基因转录表达变化分析被引量：1
- 2010年
- 目的:应用全基因组DNA芯片技术分析从37℃转入10℃后冷刺激作用下副溶血弧菌基因转录表达变化。方法:10℃低温分别作用于副溶血弧菌20、40和60min后,收集以上3个时间点和正常对照组的菌体,提取RNA,进行一个连续的时相分析。在每一个时间点的细菌基因表达分别与对照组(冷处理前37℃生长状态)相比较,获取每个时间点和正常对照组的基因转录表达上下调的倍数或者其对数值,以荧光信号的变化倍数值为2作为一个临界点,结合SAM分析软件选取基因变化倍数较大的数值。结果:在冷刺激后20、40、60min3个时间点可以检测到大量的转录水平发生明显变化的基因,对于这些发生变化的基因,根据各个时间点的变化规律,进行了分簇归类分析,共分为9簇,每一个簇都存在一种独特的时间依赖的表达模式。在每个相关的时间点,代谢相关的基因以下调为主。面对突然而急剧的温度变化,细胞膜相关的代谢基因发生了明显的重塑。结论:通过对体外低温环境下副溶血弧菌的比较转录谱分析,得到了在低温条件下基因转录发生明显变化的细胞代谢和毒力因子等相关基因,为副溶血弧菌基因转录调控网络的研究提供了一定的理论依据。
- 杨雷徐国昌毛秉豫
- 关键词：副溶血弧菌DNA芯片
- 副溶血性弧菌全基因组DNA芯片的研制和质量评价被引量：3
- 2010年
- 【目的】研制副溶血性弧菌全基因组芯片,建立芯片杂交方法,并对芯片质量进行评价。【方法】利用副溶血性弧菌全基因组序列,挑选出4770条基因,PCR扩增各基因并将PCR产物纯化,点样制备芯片;设计了两个质控杂交组合,采用双色荧光杂交策略,对芯片质量进行评价;PCR方法验证部分芯片结果。【结果】芯片杂交与理论预期结果以及PCR验证结果完全一致。【结论】成功的研制了一批质量良好的副溶血性弧菌全基因组DNA芯片,并建立了基于DNA芯片的副溶血性弧菌比较基因组学技术平台,建立了一套系统的芯片数据分析的标准方法。
- 韩海红曾小涛殷胜骏杨瑞馥刘秀梅周冬生
- 关键词：副溶血性弧菌DNA芯片比较基因组学进化基因组学功能基因组学
- 牛磺酸作用下副溶血弧菌基因转录表达变化分析
- 2011年
- 目的利用全基因组DNA芯片技术分析牛磺酸作用下副溶血弧菌基因转录变化概况,界定受牛磺酸直接调控的基因,研究其表达调控变化规律。方法分别采用"牛磺酸持续刺激培养(CTG)"和"中间添加牛磺酸刺激培养(STG)"方案,在副溶血弧菌生长的培养基中添加50 mmol/L牛磺酸,孵育至对数中期OD600=1.2,收集菌体,提取RNA,应用全基因组DNA芯片分别分析比较其和正常对照组的基因转录变化特征,并对比分析两个不同的转录表达谱基因变化特点,界定出可能受牛磺酸直接调控的基因群。同时,应用实时定量逆转录多聚酶联反应对芯片结果进行验证。结果和对照组相比,CTG实验中,总计有255个基因的转录表达发生显著性变化,上调的基因明显占主导优势;STG实验中,共有129个基因的转录表达发生显著性变化,同样以上调的基因占优势地位。综合分析两个表达谱基因转录表达特征表明,44个基因可能受牛磺酸直接影响调控,分别涉及硫代谢、谷胱氨酸代谢、铁离子代谢、核糖体加工合成等。实时定量逆转录多聚酶联反应结果证实其和芯片数据结果有很强的相关性。结论我们应用DNA芯片技术描绘出了受牛磺酸影响的副溶血弧菌基因转录表达变化概图,并推测,蛤蜊、扇贝等海洋生物体内含量丰富的牛磺酸资源可能为副溶血弧菌的滋生和繁殖提供了重要保障。
- 杨雷马长德谢东霞徐国昌毛秉豫周冬生
- 关键词：副溶血弧菌牛磺酸芯片转录调控
- 副溶血弧菌生物膜相关基因突变株的构建被引量：8
- 2013年
- 目的构建副溶血弧菌生物膜相关基因突变株并进行验证。方法采用PCR方法扩增得到靶基因的上下游同源臂片段，然后以上下游同源臂片段为模板，PCR扩增得到同源臂融合片段。将同源臂融合片段经酶切处理后克隆到自杀质粒pDSl32中。通过结合转移的方式将携带有同源臂融合片段的重组质粒转入副溶血弧菌RIMD2210633中，利用同源重组得到突变株。用PCR方法筛选和鉴定突变株，同时对突变株进行表型分析，从而在分子水平和表型试验上验证突变株是否构建成功。结果构建得到了分别携带副溶血弧菌生物膜相关基因vbfa、crp、hns、swrZ、swrT、cpsR融合同源臂片段的重组质粒，通过PCR扩增，分别得到了大小为1190、1128、1136、953、1242、1112bp的片段；用重组质粒构建了相应的突变株（AvbfR、Acrp、Ahns、AswrZ、AswrT和AcpsR），进行PCR鉴定时，突变株得到了大小分别为1190、1128、1136、953、1242、1112bp的扩增产物，比阳性对照分别小610、739、421、542、427、1367bp；用靶基因内部的引物进行扩增时，无扩增产物；选其中一株突变株Ahns进行生物膜形成能力表型分析，结果表明突变株Ahns生物膜形成量与野生株相比明显增加。结论构建得到了6株副溶血弧菌生物膜相关基因突变株，并从分子和表型试验上验证了突变株构建正确。
- 李迎丽张义全闫小娟刘梦颖杨瑞馥邱景富周冬生
- 关键词：弧菌属质粒生物膜基因敲除技术
