长江学者和创新团队发展计划(IRT0555-9)
- 作品数：10 被引量：52H指数：4
- 相关作者：文心田曹三杰黄小波肖国生杨恒更多>>
- 相关机构：四川农业大学重庆三峡学院中国兽医药品监察所更多>>
- 发文基金：长江学者和创新团队发展计划四川省教育厅资助科研项目四川省重点科技攻关项目更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 间接ELISA检测副猪嗜血杆菌抗体方法的建立
- 本研究以副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)超声波破碎抗原作为诊断抗原,建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA诊断方法。结果表明:抗原最佳稀释度为1:100;阳性血清最佳稀释度为1:320...
- 刘娜曹三杰黄小波文心田方夏云
- 关键词：副猪嗜血杆菌酶联免疫吸附试验抗体
- 文献传递
- 猪传染性胃肠炎病毒检测基因芯片的初步构建
- 本研究采用PCR方法扩增制备了一批靶基因并进行了纯化,对检测芯片的靶基因点样浓度、探针浓度、杂交温度、杂交时间进行了选择,对构建TCE检测芯片的靶基因进行了筛选和TGE探针的标记试验。结果表明质粒PER扩增和采用异丙醇沉...
- 黄小波曹三杰文心田
- 关键词：猪传染性胃肠炎病毒基因芯片
- 文献传递
- 胸膜肺炎放线杆菌apxIIC^-/kan^(r+)基因缺失减毒株的构建被引量：1
- 2012年
- 重组转移载体pBSKA通过电转化导入亲本菌胸膜肺炎放线杆菌血清7型(APP-7)WF83株,电转化后的产物涂布于TSB/Kan平板,2 d获得突变株。卡那霉素抗性实验证实突变株有卡那霉素抗性;NAD依赖性实验证实突变株依赖NAD生长;PCR鉴定证实了卡那霉素抗性基因置换了apxIIC基因,并证实突变株中无pBSKA质粒的存在;溶血活性实验证实突变株完全失去了溶血活性;细胞毒性实验证实突变株的细胞毒性完全丧失;对小鼠的安全性实验证实突变株的毒力显著减弱,突变株对小鼠是安全的;遗传稳定性实验证实,突变株在体外连续传30代和在体内传10代均不会发生卡那霉素抗性的丢失。结果表明实验成功构建了基因缺失减毒株,为进一步以此突变株作为基因工程弱毒活疫苗株开展研究奠定了一定的基础。
- 李建曹三杰文心田黄小波都启晶张明余慧
- 关键词：胸膜肺炎放线杆菌电转化突变株
- 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)诊断DNA微阵列的构建被引量：4
- 2007年
- 为构建猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）诊断DNA微阵列，应用RT—PCR从猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）C14—2分离株和欧洲型弱毒疫苗株VP046扩增并克隆获得戋洲型重组质粒C14P9（基因号：AY775132）、PRRS—PS9（基因号：AY775134）、Ulb（基因号：AY775135）、Y11（基因号：AY775133）、Y12（基因号：AY775136）和欧洲型基因重组质粒E6和E8。PCR法制备的靶基因和探针纯化后，质量浓度分别为300～600mg／L和200-400mg／L。芯片杂交动力学研究表明，杂堑信号强度随靶基因和探针浓度的增加而增强，最佳靶基因质量浓度为200mg／L，探针适宜范围为3～3000μg／L，系统灵敏性为3μg／L。靶基因杂交特异性研究表明，除个别靶基因在某一温度下存在交叉反应和杂交信号弱外，大多数靶基因在40～56℃下杂交信号强。采用AY775133、AY775134、E6和E8靶基因构建PRRS诊断DNA微阵列在40℃下预杂交1h、48℃湿盒避光杂交6h后经洗涤和扫读分析，杂交信号强、斑点明显、特异性高，按SNR≥1．5为标准能够区分PRRSV蔓洲型和欧洲型。应用PRRS诊断DNA微阵列检测了AMERVAC-PRRS、PRRSV弱毒疫苗、C14—2株、SCU株和临床样本，能正确区分PRRSV基因型。研究结果表明构建的PRRS诊断DNA微阵列可用于PRRS临床诊断和基因分型。
- 肖驰曹三杰文心田
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒DNA微阵列克隆
- 猪胸膜肺炎放线杆菌ArcA基因在低氧环境下的转录变化
- 2008年
- 为研究低氧条件对猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)血清1型ArcA基因表达的影响,并探讨ArcA在低氧环境中的作用机制,作者建立了体外培养模型,在低氧环境中培养APP,采用半定量RT-PCR方法,以看家基因recF为内参,检测ArcA基因在低氧条件下的表达水平。结果表明ArcA基因在常氧条件下不转录或低转录,而在低氧环境下高转录,并呈现转录量先升高后降低的趋势。这表明ArcA基因可能是胸膜肺炎放线杆菌潜在的毒力基因,在致病过程中发挥重要作用。
- 段丽丽文心田曹三杰黄小波
- 关键词：半定量RT-PCR猪胸膜肺炎放线杆菌缺氧
- 猪传染性胃肠炎病毒检测基因芯片的构建被引量：15
- 2009年
- 采用PCR扩增制备TGEV的靶基因并进行纯化，对基因芯片的最佳靶基因点样质量浓度、探针质量浓度、杂交温度、杂交时间进行筛选，选择构建检测芯片的最适靶基因，进行基因芯片探针最佳标记方法试验。结果表明，质粒PCR扩增和采用异丙醇沉淀纯化的靶基因质量好，基因芯片最佳靶基因点样质量浓度为200mg／L，最佳探针质量浓度为3000μg／L，预杂交时间为1h，杂交时间为3～6h，杂交温度为48℃，以S、S3、sM、M、N、ORF7、POL等7个靶基因为构建TGEV检测芯片的最适靶基因，确定了多重PCR扩增标记TGEV探针的最佳体系，Cy3-dCTP标记浓度为2．5μmol／L，构建的TGEV检测芯片与标记的混合探针杂交效果好。
- 曹三杰黄小波文心田肖国生
- 关键词：猪传染性胃肠炎病毒基因芯片
- 胸膜肺炎放线杆菌荚膜多糖输出基因部分序列的克隆鉴定、序列拼接和分析应用被引量：1
- 2007年
- 用设计的引物对胸膜肺炎放线杆菌1、3、6、9型标准株的荚膜多糖输出部分基因序列进行了扩增，克隆，测序，分别获得4个型的部分cpxDC基因序列和3型的部分cpxD基因序列。对克隆序列和GenBank中已知序列进行序列拼接，分别拼接出1、3、6型的荚膜输出cpxD基因全序列。通过基因序列分析发现，胸膜肺炎放线杆菌1、3、5、6、9型荚膜多糖输出基因已知序列间的同源性很高，达89％～99．88％。1、3、5、6型cpxD基因的推导氨基酸序列间的同源性为93％～99％。在cpxDC基因的保守区内设计出1对种特异性引物，对胸膜肺炎放线杆菌进行鉴定和检测，结果从8个标准型菌株和3株分离株中均扩出约720bp的阳性片段，其他6种能引起猪呼吸道疾病的细菌均呈阴性。所建立的PCR方法最低检出量为10Pg，最适模板量为5ng（50ptL）。试验结果表明，胸膜肺炎放线杆菌不同血清型间的荚膜多糖输出基因存在着高度的保守性。设计出的种特异性引物能用于胸膜肺炎放线杆菌的检测和鉴定。
- 肖国生曹三杰段丽丽文心田肖驰马晓平杨利
- 关键词：克隆鉴定PCR
- 携带TGEV DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建及安全性与免疫性分析被引量：10
- 2009年
- 【目的】探讨以减毒沙门氏菌为载体,进行TGEV DNA疫苗口服免疫可行性。【方法】通过RT-PCR扩增TGEV四川株(SC-H)S基因5’端约2.1 kb的主要抗原位点片段,将其插入真核表达载体pVAX1,构建重组质粒pVAX-S,体外转染COS-7细胞,间接免疫荧光检测S基因表达。通过电转化将pVAX-S转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建SL7207(pVAX-S)重组菌,并在体外感染小鼠腹腔巨噬细胞,以RT-PCR、间接免疫荧光检测细胞内S基因的转录与表达情况。将SL7207(pVAX-S)重组菌以5×108、1×109、2×109CFU剂量口服接种BALB/c小鼠,分析其安全性,并以1×109CFU剂量的重组菌3次免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA检测免疫小鼠的血清IgG与肠道粘膜IgA抗体。【结果】成功构建重组质粒pVAX-S,且重组质粒能在COS7细胞中表达。重组菌SL7207(pVAX-S)感染巨噬细胞后检测到目的基因的转录、表达。小鼠口服接种不同剂量重组菌,具有良好的安全性。免疫小鼠于二免后两周可检测到针对TGEV S蛋白的特异性血清IgG与肠道粘膜IgA抗体,且三免后两周与SL7207(pVAX1)空载体免疫组间分别存在显著性差异(P<0.05)和极显著性差异(P<0.01)。【结论】携带TGEV DNA疫苗的减毒沙门氏菌小鼠试验显示了良好的免疫原性与安全性。
- 杨恒刘佳文曹三杰黄小波文心田
- 关键词：猪传染性胃肠炎病毒S基因减毒沙门氏菌DNA疫苗安全性
- 胸膜肺炎放线杆菌基因芯片分型
- 本试验根据胸膜肺炎放线杆菌外膜脂蛋白(omlA)、apx毒素和荚膜多糖(cp)三个不同型特异性基因,选用和设计了15对引物,并从扩增的17个靶基因中选用15个靶基因用于制备胸膜肺炎放线杆菌基因分型的基因芯片。用优化后的多...
- 肖国生曹三杰文心田
- 关键词：基因芯片胸膜肺炎放线杆菌基因分型
- 文献传递
- 传染性胸膜肺炎放线杆菌apxⅡC-/kanr+基因缺失减毒株重组转移载体pBSKA的构建
- 根据Prideaux等(1999)的引物和传染性胸膜肺炎放线杆菌血清7型菌(APP-7)L25-4株的apxⅡ操纵子的部分序列设计并合成了两对引物,从APP-7WF83株PCR扩增apxⅡC基因上游2,200bp左右的片...
- 李建文心田曹三杰黄小波张明
- 关键词：传染性胸膜肺炎放线杆菌突变株基因缺失
