教育部“新世纪优秀人才支持计划”(NCET-04-0502)
- 作品数：24 被引量：221H指数：8
- 相关作者：姜平李玉峰蒋文明王先炜杜以军更多>>
- 相关机构：南京农业大学江苏出入境检验检疫局更多>>
- 发文基金：教育部“新世纪优秀人才支持计划”国家自然科学基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- DNA免疫法研制抗猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白中和性单克隆抗体被引量：7
- 2006年
- 目的：研制抗PRRSVM蛋白的单克隆抗体（McAb），以期获得中和性单克隆抗体。方法：将PRRSVM蛋白的基因克隆入真核表达载体pcDNA3．1，利用构建成的重组真核质粒免疫BALB／c小鼠，采用杂交瘤技术制备抗PRRSVM蛋白的单抗，建立间接ELISA方法筛选阳性克隆。利用试剂盒检测Ig亚类。通过免疫印迹（Western blot）、间接免疫荧光试验（IFA）鉴定McAb的特异性。间接ELISA和病毒中和试验检测杂交瘤细胞上清McAb效价和腹水McAb效价。结果：获得3株可分泌特异性抗PRRSVM蛋白抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1A7、4G3、51：3。1A7和4G3的Ig亚类为IgM。ELISA检测杂交瘤细胞培养上清效价为1：54～1：1024，腹水效价为1：3200～1：10240。同时用Western blot、IFA检测，结果均是阳性。4G3和1AT相对亲和力不同，证明其识别不同抗原位点。1AT和4G3具有病毒中和活性，中和效价达到1：96。结论：获得2株特异性抗PRRSVM蛋白的中和性单抗，为PRRSV诊断和免疫预防研究奠定了重要基础。
- 马苏姜平李玉峰段舒怡
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体M蛋白质粒中和抗体
- 猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白重组腺病毒的构建与鉴定被引量：16
- 2006年
- 猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)是近年来新发现的引起仔猪多系统衰弱综合症的必需病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap),其中Cap含有病毒主要抗原表位,是研究PCV2基因工程苗的主要候选目的基因。本研究利用PCR技术将Cap蛋白基因克隆入人5型腺病毒穿梭载体(pShuttle-CMV),与腺病毒骨架载体(pAdEasyTM)共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒rAd-Cap,测定其TCID50为1013.7/mL。用RT-PCR、间接ELISA、Westernblot和IPMA等方法证明了Cap蛋白在腺病毒中获得表达。该研究为发展PCV2的重组腺病毒基因工程疫苗奠定了基础。
- 王先炜姜平李玉峰蒋文明汤景元
- 关键词：CAP蛋白腺病毒
- 串联表达PRRSV M与GP5蛋白重组腺病毒的构建及其免疫特性研究被引量：16
- 2006年
- 利用PCR扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒的M基因,按正确的读码框与GP5基因串联,成功构建穿梭载体pShuttle-CMV-M-GP5,经PCR、测序鉴定正确。PmeⅠ线性化后在BJ5183大肠杆菌内与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组,产生重组腺病毒DNA。重组腺病毒DNA经PacⅠ线性化后用脂质体转染HEK-293A细胞,在细胞内包装成完整的腺病毒,通过IFA可以检测到M与GP5串联的重组腺病毒构建成功,可以正确地表达目的蛋白。将构建好的重组腺病毒免疫小鼠,结果表明可以诱导产生较强的体液免疫应答(ELISA抗体和中和抗体)和细胞免疫应答(淋巴细胞增殖和CTL反应)。证明该重组腺病毒具有较好的免疫原性,为下一步猪体免疫试验奠定了基础。
- 蒋文明姜平李玉峰汤景元王先炜杜以军
- 关键词：PRRSVMGP5重组腺病毒体液免疫
- 猪圆环病毒2型感染的检测与流行病学调查被引量：26
- 2008年
- 根据GenBank上发表的PCV2 ORF2和PRRSV ORF7序列设计合成引物,建立分别用于检测PCV2和PRRSV的PCR和RT-PCR方法,并对2003年9月至2005年5月采自189个可疑发病猪场的389份病料进行了PCV2和PRRSV的检测。结果显示,来自33个猪场的35份样品为PCV2阳性,猪场PCV2阳性率为17.1%;PCV2与PRRSV混合感染率为5.1%,PCV2阳性猪场中PRRSV感染率为57.6%。流行病学统计结果表明,安徽省猪场PCV2阳性率最高;安徽省和广西省猪场PCV2和PRRSV的混合感染最严重;春夏季节PCV2阳性率明显高于秋冬;消瘦、被毛粗乱是PCV2感染的主要特征;淋巴结水肿或出血,肾脏肿大、出血或呈灰白色以及脾脏病变是PCV2感染的主要病理变化;仔猪7～8周龄发病率最高。
- 张治涛李玉峰姜平王先炜邓雨修
- 关键词：猪圆环病毒2型流行病学猪繁殖与呼吸综合征病毒
- 地高辛标记cDNA探针检测猪繁殖与呼吸综合征病毒被引量：8
- 2007年
- 本研究以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S1株ORF7基因为模板,通过RT-PCR技术扩增出394 bp的cDNA。用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物,并以此为模板制备出地高辛标记的cDNA探针。特异性试验表明,该探针仅与PRRSV核酸反应,与PPV、PRV、FMDV、HCV及PCV2的核酸反应为阴性。敏感性检测表明,采用CSPD化学发光检测时,硝酸纤维素膜上最低检出量为62.5 pg;尼龙膜上最低检出量为0.5 pg。应用该探针,在尼龙膜上对10份PRRSV阳性病料的组织RNA样品进行检测,结果均为阳性,与RT-PCR检测结果一致,证明该方法可用于PRRSV临床样品检测。
- 李广明姜平李玉峰秦承学
- 关键词：地高辛标记探针斑点杂交化学发光
- 1株肾型鸡传染性支气管炎病毒的鉴定被引量：1
- 2009年
- 鸡传染性支气管炎病毒(IBV)具有不同致病特性,将IBV XDC-2株接种9日龄SPF鸡胚培养,可引起鸡胚死亡和出现侏儒胚,病毒EID50达5×10-5.33/mL。将IBV XDC-2株接种18日龄SPF鸡,饲养观察14 d,病鸡临床症状表现为:精神沉郁,羽毛凌乱,双翅下垂,轻微腹泻,多数拉白色水样稀粪。病死鸡出现肾肿大、呈花斑状、大量尿酸盐沉积。鸡发病率为100%,死亡率为25%。死亡鸡肺脏、肾组织制作组织切片,发现病理变化明显,主要为:肾小管扩张,上皮细胞呈玻璃样变性,部分管腔内可见坏死脱落之上皮细胞,于肾间质可见大量单核细胞浸润,肾间质有充血、出血现象;肺内动脉、毛细血管充血,淋巴细胞浸润。死亡鸡肺脏、肾组织接种鸡胚分离病毒,RT-PCR检测结果为阳性,表明该分离株为鸡传染性支气管炎病毒,具有很强的嗜肾性。
- 张莉莉曹国林Basit李文良许家荣王先炜姜平
- 关键词：鸡传染性支气管炎RT-PCR
- 猪口蹄疫病毒多抗原表位的原核表达与纯化被引量：4
- 2006年
- 利用限制性酶切从重组质粒pShuttle-CMV-VP中得到猪O型口蹄疫病毒VP1(21-60)-(141-160)-(200-213)位氨基酸的基因。将此多抗原表位基因克隆至原核高效表达载体pET43.1 a(+),在E.coliBL21中用IPTG诱导表达了含有猪口蹄疫病毒多抗原表位的融合蛋白,并用镍柱亲和层析法获得了纯化蛋白。W estern-b lot结果表明融合蛋白可被猪O型口蹄疫病毒标准阳性血清所识别,从而为进一步研究FMDV多表位抗原的免疫特性和诊断方法奠定了基础。
- 杜以军姜平蒋文明李玉峰
- 关键词：口蹄疫病毒表位原核表达
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSP2的原核表达及其单克隆抗体的制备被引量：6
- 2008年
- 将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S1株截短修饰的NSP2蛋白基因(tNSP2),克隆于pGEX-6P-1载体中,转化大肠杆菌后用IPTG诱导表达。Western blot结果表明,融合表达的GST-tNSP2蛋白能被PRRSV阳性血清特异性识别,大小约50kDa。经GST柱提取纯化蛋白GST-tNSP2,免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,获得2株能稳定分泌抗NSP2蛋白抗体的杂交瘤细胞株,将其命名为2B5、3H3,亚型鉴定结果均为IgG1型,其轻链均为κ链。间接免疫荧光试验证明,2B5和3H3均能与PRRSV S1毒株产生特异性反应,而不能与SY0608毒株反应,从而为PRRSV分离株的鉴定及NSP2功能研究奠定了重要基础。
- 王海燕姜平杜以军李玉峰李军星沈芳
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体原核表达
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白中和性单克隆抗体的制备与免疫学特性测定被引量：4
- 2008年
- 利用重组真核质粒pcDNA3-GP5免疫BALB／c小鼠，取脾细胞和骨髓瘤细胞SP2／0融合，经间接ELISA筛选和3次有限稀释法克隆，得到3株能稳定分泌抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5蛋白的单克隆抗体（McAb）杂交瘤细胞株，分别命名为4C9、5D10、5F12，其中5D10的Ig亚类为IgM。ELISA检测杂交瘤细胞培养上清液抗体的效价为1：64～1：1024，腹水的效价为1：3200～1：10240，IFA和IPMA的检测结果均为阳性。Western-blot检测证明，这3株McAb均针对PRRSV的GP5蛋白。中和试验表明，5D10和5F12具有病毒中和活性，中和效价分别为1：40和1：80。5D10相对亲和力大于5F12，3株细胞连续培养20代后仍能稳定分泌抗体，表明抗GP5蛋白中和性McAb制备成功。
- 马苏戴建君李玉峰段舒怡姜平
- 关键词：GP5蛋白单克隆抗体中和抗体
- 猪生殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白抗原表位基因的表达及其表达产物的抗原性被引量：3
- 2007年
- 为了确定猪生殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白A、B抗原表位之间的相互关系和对免疫的影响,应用PCR方法扩增出A、B抗原表位基因并分别克隆于原核和真核表达载体中。原核重组质粒表达的重组蛋白经Western-blotting检测证明,该重组蛋白具有良好的抗原性。将重组蛋白和真核表达质粒免疫小鼠,前者可诱导产生针对PRRSV的特异性ELISA抗体,但是此抗体没有中和活性;后者不能诱导免疫小鼠产生PRRSV特异性抗体。结果表明,中和抗体的产生不但与A、B表位的空间构象有很大的关系,如果蛋白质分子质量过小也不能诱导机体产生有效的免疫反应。
- 顾小雪李玉峰姜平黄娟韩研妍
- 关键词：猪生殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白抗原表位
