国家自然科学基金(30270584)
- 作品数：5 被引量：14H指数：3
- 相关作者：朱道银李俊明伊正君江山骆旭东更多>>
- 相关机构：重庆医科大学南昌大学第一附属医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- 结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白ICL的表达及鉴定被引量：6
- 2005年
- 目的 表达结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白ICL ,鉴定其生物学活性并制备其多克隆抗体。方法 采用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出icl基因片段 ,将其插入原核表达质粒pQE30 ,构建重组质粒 pQE30 icl。将pQE30 icl转化大肠杆菌 ,用IPTG诱导目的基因表达。Western blot免疫印迹法鉴定后纯化该表达产物 ,测定其酶活性并用此纯化蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果 序列分析发现PCR扩得的icl有两个核苷酸突变 ,但均为无义突变。在大肠杆菌中表达的目的产物经SDS PAGE分析约为 4 7kDa。免疫印迹分析证实目的蛋白与阳性结核病患者抗血清产生特异性反应。纯化的目的蛋白异柠檬酸裂解酶的酶活性为 16 .7u/mg。双向免疫扩散法测定目的蛋白免疫兔血清的抗体效价为 1 32。结论 研制出的结核分枝杆菌重组ICL具有异柠檬酸裂解酶活性和抗原性 ,重组ICL和抗ICL免疫血清的制备为抗结核分枝杆菌潜伏感染的研究奠定了必要的物质基础。
- 李俊明朱道银伊正君骆旭东江山
- 关键词：结核分枝杆菌
- 10-23脱氧核酶对结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶表达的影响及其抗菌作用被引量：4
- 2006年
- 目的探讨10-23脱氧核酶(deoxyribozyme,DRZ)抑制结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶(isocitrate lyase,ICL)的表达及其在抗结核分枝杆菌感染中的作用。方法根据计算机模拟的结核分枝杆菌ICL mRNA的二级结构设计合成5条ICL特异的10-23 DRZ(DZ1～DZ5),在无细胞反应体系中鉴定其对结核分枝杆菌ICL mRNA的切割活性后,在不同条件下用DZ4对结核分枝杆菌进行处理,于处理后不同时间检测ICL酶活性变化,间接酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测ICL的表达。用异烟肼单独处理及DZ4与异烟肼联合处理后的结核分枝杆菌感染人巨噬细胞系THP-1细胞,于感染后不同时间用Ziehl-Heelson染色法和结核分枝杆菌培养计数的方法,观察10-23DRZ对结核分枝杆菌感染巨噬细胞的影响,同时取经异烟肼单独处理及DZA与异烟肼联合处理后的结核分枝杆菌接种于Middle Brook 7H10(M7H10)培养基,观察10-23DRZ对在巨噬细胞外生长的结核分枝杆菌的影响。结果DZ1、DZ3、DZ4和DZ5在无细胞反应体系中可对ICL mRNA进行有效切割,且其活性具有高度特异性。5μmol／L DZ4与异烟肼联合应用时可显著抑制结核分枝杆菌ICL的表达,与单用相应浓度的异烟肼比较,处理1、2、3周后结核分枝杆菌ICL酶活性分别下降34．9％、46．6％、46．7％(异烟肼10μg／L)或21．9％、33．48、36．9％(异烟肼5μg/L)。DZ4与异烟肼联合处理后的结核分枝杆菌在巨噬细胞内存活的能力显著下降,在感染后4 d和7 d时,THP-1细胞内的荷菌量分别由单用相应浓度异烟肼处理对照组的126．5×104 CFU、307．5×104 CFU(异烟肼10μg／L)和133．0×104 CFU、325．4×104 CFU(异烟肼5μg／L)下降至54．6×104 CFU、114．3×104 CFU和71．7×104 CFU、174．4×104 CFU。10-23DRZ对结核分枝杆菌在M7H10培养基中生长无明显影响。结论异烟肼可有效促进10-23DRZ进入结核分枝杆菌;10-23DRZ与亚抑菌浓度的异烟肼联用可有效抑制结核分枝杆�
- 李俊明李娜朱道银伊正君刘晔华杨春何永林
- 关键词：分枝杆菌结核基因表达
- icl mRNA特异性10-23DRz在小鼠体内抗结核分枝杆菌感染的实验研究被引量：1
- 2010年
- 目的探讨iclmRNA特异性10-23脱氧核酶(deoxyribozyme,DRz)对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)在小鼠体内感染的影响,及其单独或与异烟肼(isoniazidum,INH)联合应用治疗小鼠结核病的效果。方法分别用DZ4、INH、INH+DZ4-S或INH+DZ4对Mtb进行预处理,再用上述经过预处理的Mtb感染BALB/c小鼠,一定时间后进行小鼠肺组织Mtb培养及病理学改变观察。利用DZ4-FITC溶液对BALB/c小鼠进行滴鼻处理,检测滴鼻途径给药的效果。采用尾静脉注射法建立小鼠结核病模型,将模型小鼠随机分为5组(n=10),分别给予生理盐水、DZ4、INH、INH+DZ4、INH+DZ4-polyG治疗,于治疗完成2周后进行小鼠肺组织Mtb荷菌量检测和病理学改变观察。结果Mtb感染后2周,各组小鼠的肺组织荷菌量均无显著性差异(P>0.05)。感染进行至4～12周时,INH+DZ4预处理组Mtb感染小鼠的肺组织荷菌量较其它各组均显著偏低(P<0.05),肺组织的病理改变较其他各组也明显轻微。经滴鼻途径给予DZ4-FITC溶液4h后,小鼠肺组织冰冻切片在荧光显微镜下可见强烈的黄绿色荧光,并至少持续48h。对小鼠结核病模型的治疗结果显示,DZ4单独治疗组小鼠肺组织荷菌量及病理表现与未治疗组无显著差异;加用INH治疗的各组小鼠肺组织荷菌量与生理盐水组比较有显著下降(P<0.05),肺组织病理表现也明显轻微,但10-23DRz和INH联合治疗组与INH单独治疗组在肺组织荷菌量和病理表现上均无显著性差异。结论10-23DRz与INH联合预处理可有效降低Mtb感染小鼠的能力;本研究未发现10-23DRz对结核病具有治疗作用或辅助治疗作用。
- 李俊明朱道银王娜罗清万腊根
- 分枝杆菌融合表达ICL-GFP穿梭质粒的构建及鉴定被引量：2
- 2005年
- 目的 :构建融合表达ICL GFP的E .coli 分枝杆菌穿梭载体 ,在耻垢分枝杆菌 (MS)中融合表达结核分枝杆菌(MTB)潜伏感染相关蛋白异柠檬酸裂合酶 (ICL)及绿色荧光蛋白 (GFP) ,为抗MTBICL的表达及抗MTB潜伏感染的药物筛选奠定基础 .方法 :采用PCR法从MTBH37Rv基因组DNA中扩增出icl基因 ,克隆入pcDNA3.1(+) ,构建重组质粒pcD NA icl.用PCR法自pUV15中扩增出gfp基因 ,克隆入pcDNA icl中icl基因片段的下游 ,构建重组质粒pCDIG .鉴定无误后 ,将icl gfp融合基因从pCDIG中亚克隆入pUV15 ,构建融合表达ICL GFP的穿梭质粒pUVIG .将pUVIG电转化MS ,经潮霉素B筛选后 ,抽提质粒用PCR法鉴定 .培养MS的阳性转化子 ,在荧光显微镜下观察GFP的表达 ,Western blot法检测ICL的表达并检测ICL GFP融合蛋白的ICL活性 .结果 :所克隆的icl序列出现一个碱基突变 ,为无义突变 .gfp序列完全正确 .重组质粒pUVIG能在E .coli MS间进行穿梭 ,并在MS中表达ICL GFP融合蛋白 .该融合蛋白同时具有GFP的自发荧光功能和ICL的酶活性 .结论 :成功构建能在MS中表达ICL GFP融合蛋白的E .coli 分枝杆菌穿梭质粒 .
- 李俊明朱道银伊正君江山骆旭东
- 关键词：结核分枝杆菌绿色荧光蛋白穿梭质粒
- 结核分枝杆菌ICL mRNA特异性10-23脱氧核酶切割活性的鉴定及其切割特点被引量：4
- 2006年
- 为鉴定结核分枝杆菌异柠檬酸裂合梅（ICL）特异性的10-23DRz在无细胞体系切割ICL mRNA的活性，并探讨其在不同条件下以及联合应用时对靶mRNA的切割特点，采用计算机软件模拟ICL mRNA的二级结构，据此选择适合的待切割靶点并设计针对相应靶点的特异性10—23DRz（DZ1～DZ5）．PCR法扩增获得纠基因并克隆入质粒pET32a＋．采用T7 RNA聚合酶体外转录法获取ICL全长mRNA后分别用DZ1～DZ5在无细胞体系中对ICL mRNA进行切割，切割产物经变性聚丙烯酰胺凝胺电泳后用银染法鉴定各DRzs的活性．选择切割活性最强的DZ4考察不同10—23DRz剂量、不同反应时间、不同镁离子浓度条件下及不同错配或突变10—23DRz的切割特点．联合应用DZ1、DZ4及DZ5在无细胞体系中对ICL mRNA进行切割。检测10—23DRz联合应用对切割效率的影响．结果表明，DZ1、DZ3、DZ4及DZ5可在无细胞体系中有效地切割ICL mRNA，其切割效率在30．8％～64．5％之间．对DZ4切割活性的检测发现，其对靶mRNA的切割具有剂量和时间的依赖性；在2—20μmol／L范围内，DZ4的切割活性与Mg^2＋浓度呈正相关；DZ4单侧底物结合臂上含一个不与靶mRNA配对的碱基时其切割效率大大降低，两侧底物结合臂上各含一个不配对的碱基或活性中心域第6位出现碱基突变（G—C）时，DZ4完全丧失切割活性．联合应用2种或2种以上10-23DRz可显著增强对底物RNA的切割效率．10-23DRz特异、有效地切割结核分枝杆菌ICL全长mRNA并显示一定的叠加效应，有望用于抗结核分枝杆菌潜伏感染的基因治疗．
- 李俊明朱道银伊正君江山骆旭东
- 关键词：结核分枝杆菌
