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优化重组人C-反应蛋白在酵母中的分泌表达: 2013年; 目的：通过优化引导蛋白分泌的信号肽（signal peptide，SP），构建高效分泌表达具有免疫活性的重组人C-反应蛋白（recombinant human C-reactive protein，rhCRP）的毕赤酵母菌株。方法：通过重叠PCR和DNA重组技术，分别将信号肽MFαSP、CRNSP、SUC2SP和MFα-op SP的基因重组到rhCRP基因的5’端后克隆到毕赤酵母表达载体上．获得的4种重组质粒分别重组到毕赤酵母菌x．33中进行甲醇诱导分泌表达，Western blot法鉴定蛋白分泌情况;利用HisTrap HP柱纯化rhCRP后用间接ELISA法鉴定其免疫反应性。结果：成功构建了4种重组质粒。4种sP能引导表达出大小约为23kD的rhcRP，其中MFdSP引导rhCRP分泌的量约为另外3种信号肽的3-12倍。间接ELISA检测表明，纯化的rhCRP具有特异的免疫反应性。结论：成功筛选出了高效分泌表达rhCRP的重组毕赤酵母菌株并表达、纯化得到具有免疫反应性的rhCRP，为rhCRP相关的进一步临床及基础研究奠定了基础。; 李军明林衡葛高顺张立超胡学军; 关键词：C-反应蛋白毕赤酵母信号肽分泌表达

大肠杆菌体内高效表达N-糖基化修饰蛋白研究模型的构建: ＜正＞N-糖基化修饰是改善药物蛋白理化性质、改善药代动力学特性、提高药效的重要方法。应用大肠杆菌表达N-糖基化蛋白可获得均质性糖蛋白,其相关研究已成为糖工程领域研究热点之一。目前,利用空肠弯曲杆菌糖基化修饰系统pgl; 丁宁杨春光马君燕孙慎侠李梦阳胡学军张嘉宁; 文献传递

重组人C反应蛋白在甲醇酵母中的分泌表达及鉴定: 2013年; 目的构建重组人C反应蛋白(rhCRP)甲醇酵母分泌表达菌株,表达、纯化rhCRP并鉴定其免疫反应性。方法将人工设计合成的rhCRP基因克隆到甲醇酵母表达载体pPICZαA上,经SacⅠ线性化得到重组质粒pPICZαA/rhCRP后转化至甲醇酵母X-33中,利用甲醇诱导进行分泌表达,并用组氨酸标签进行亲和层析纯化rhCRP。采用SDS-PAGE、Western blotting检测表达、纯化的目的蛋白,通过间接酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定其免疫反应性和稳定性。结果成功构建人CRP的重组甲醇酵母表达载体pPICZαA/rhCRP,重组酵母菌株成功诱导分泌表达23×103的rhCRP;一步纯化即得纯度为90.42%的目的蛋白,间接ELISA法检测表明,纯化产物rhCRP具有特异的免疫反应性和一定的稳定性。结论利用甲醇酵母表达系统,成功获得了较高纯度的具有免疫反应性的rhCRP,为下一步制备抗人CRP抗体及自主研发人CRP检测试剂提供重要的实验基础。; 李军明林衡张立超葛高顺胡学军; 关键词：C反应蛋白质甲醇酵母分泌表达免疫反应性

聚乙二醇对ELP[I]_(40)相变温度的影响被引量：1: 2013年; 目的:研究聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)对类弹性蛋白(elastin-like protein,ELP)ELP[I]40相变温度(inverse temperature transition,Tt)的影响。方法:设计并合成ELP[I]40基因(由40个(VPGIG)五肽单元串联组成),表达纯化后,检测不同浓度PEG条件下ELP[I]40的Tt。结果:在ELP[I]40终浓度为25μmol/L时,PEG浓度为5%,10%,15%,20%,25%时分别使Tt由29℃降至26.5℃,22℃,15.2℃,8.8℃,2.5℃。结论:PEG可降低ELP的Tt,可通过PEG促进ELP重组蛋白分离纯化。; 林衡李军明葛高顺张立超孙利慧胡学军; 关键词：聚乙二醇相变温度分离纯化

ELP[Ⅰ]_(50)标签在重组硫氧还蛋白分离纯化中的应用及PEG对其相变温度的影响被引量：1: 2013年; 【目的】使用自行设计的类弹性蛋白(Elastin-like protein,ELP)ELP[I]50作为非色谱纯化标签,分离纯化重组硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx),并研究聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)对ELP[I]50-Trx相变温度(Inverse temperature transition,Tt)的影响。【方法】人工合成Trx基因,将其亚克隆到自行构建的表达载体pET28编码ELP[I]50标签下游,转入大肠杆菌BLR(DE3)进行表达。融合蛋白表达后,采用可逆相变循环(Inverse transitioncycling,ITC)分离纯化,并检测不同浓度PEG时的Tt值。【结果】成功表达、分离纯化出融合蛋白ELP[I]50-Trx,检测出该蛋白浓度为25μmol/L时,Tt为28.6°C;而当PEG的浓度为5%、10%、15%、20%时,Tt分别降至22.3°C、15.9°C、6°C、0°C。【结论】ELP[I]50标签高效纯化重组蛋白具有操作简便、成本较低、易于扩大的优势,而PEG能降低蛋白的Tt值,进一步增强分离纯化效果,扩大使用范围,可望应用于分离纯化多种重组蛋白。; 葛高顺张立超李军明胡学军; 关键词：硫氧还蛋白分离纯化聚乙二醇相变温度

连接肽对融合蛋白ELP[I]_(30)-linker-eGFP相变的影响被引量：1: 2013年; 研究G4S和Poly N连接肽对融合蛋白ELP[I]30-linker-eGFP相变的影响.将编码两种不同连接肽G4S和Poly N的绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)基因克隆到pET28-ELP[I]30表达载体中,在宿主菌E.coli BLR(DE3)中经IPTG诱导表达ELP[I]30-linker-eGFP,通过可逆相变循环(inverse transition cycling,ITC)及镍柱亲和层析纯化ELP[I]30-linker-eGFP蛋白.结果显示,成功构建、表达具有活性的两种连接肽的融合蛋白ELP[I]30-linker-eGFP,连接肽G4S使融合蛋白产生不可逆相变,而Poly N不影响融合蛋白可逆相变,该研究对类弹性蛋白标签的应用具有指导意义.; 张立超李军明葛高顺孔令岭胡学军; 关键词：连接肽融合蛋白绿色荧光蛋白

类弹性蛋白标签在重组蛋白分离纯化中的应用被引量：4: 2012年; 类弹性蛋白(elastin-like polypeptide,ELP)是一种非常有前途的重组蛋白分离纯化标签。这种人工合成的蛋白质多肽是由五肽重复序列单元(VPGXG)串联组成,具有温度诱导的可逆相变特性。ELP与目的蛋白融合后,赋予重组蛋白相类似的可逆相变性质。多次可逆相变循环(inverse transition cycling,ITC)之后,就可以从蛋白溶液混合液中选择性地分离出ELP融合蛋白,再经特异性酶切或者改变环境条件引发内含肽发生自我剪切去除ELP标签,从而得到单一的目的蛋白,实现简单快速分离纯化重组蛋白。目前,该技术已成功应用于原核大肠杆菌和植物表达系统中。大肠杆菌表达ELP-绿色荧光融合蛋白的最高产量可达1.6g/L。这种非色谱分离纯化重组蛋白的方法具有技术简单、操作快速、成本低、易于扩大等优点。重点从该技术的原理、技术路线以及发展方向进行综述。; 林衡许崇波孙利慧胡学军; 关键词：可逆相变重组蛋白分离纯化

疏水性ELP基因设计与基因库构建被引量：4: 2013年; 【目的】设计合成疏水性类弹性蛋白(Elastin-like polypeptide,ELP)基因,建立ELP基因库。【方法】选择疏水性最强的异亮氨酸(Ile,I)(疏水参数:4.5)取代ELP五肽重复序列单元(缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-客座氨基酸-甘氨酸,VPGXG)中客座残基X。全基因合成一段含编码(VPGIG)10序列,上游含DraⅢ酶切位点、下游含BglⅠ酶切位点的ELP单元。将DraⅢ和BglⅠ设计为一对同尾酶(Isocaudarner),利用这对同尾酶定向克隆(Recursive directional ligation,RDL)一系列不同拷贝数的ELP基因。为鉴定基因库有效性,随机选取库中ELP[I]50基因进行蛋白表达、纯化并测定其相变温度(Inverse temperaturetransition,Tt)。【结果】建立了ELP[I]n(n=10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120)基因库。测定ELP[I]50的Tt为24.3°C。【结论】首次单独选用Ile(I)作为ELP蛋白质标签中客座残基氨基酸,增加了ELP中疏水性氨基酸的含量,为进一步筛选出表达量高、Tt低、分子量小的ELP标签奠定基础。; 林衡李军明张立超葛高顺许崇波胡学军; 关键词：异亮氨酸同尾酶定向克隆

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国家自然科学基金(31070822)

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