浙江省教育厅科研计划(Y200805653)
- 作品数：3 被引量：14H指数：2
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- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- MAP30全长基因的克隆及在巴斯德毕赤酵母中的高效表达研究被引量：6
- 2010年
- 目的研究毕赤酵母中高效表达全长MAP30蛋白及其生物活性。方法根据GeneBank公布的MAP30全序列设计特异性引物,以苦瓜基因组为模板,PCR扩增MAP30全长基因,将该基因插入pPIC9k载体中,经SacI酶切线性化后,电转化至GS115细胞,再通过G418筛选,最终获得了高拷贝重组GS115菌株。重组菌株在甲醇诱导下,SDS-PAGE分析表达的特异性条带,运用Pharmacia VDS图像分析软件进行条带密度扫描,得到各条带的扫描曲线图,计算出同一泳道目的蛋白条带峰面积相对于整个曲线所占的百分比,即蛋白纯度,并根据蛋白纯度和上清蛋白总量(Lowry法)计算出发酵上清液中目标蛋白含量。纯化时首先用75%的饱和硫酸铵盐析,然后用Phenyl Sepharose6FF疏水层析,再用CM-sepharoseFF阳离子层析。采用MTT法检测MAP30蛋白对人胃癌细胞株SGC7901的抑制作用。为验证重组MAP30蛋白结构的正确性,采用EDMAN降解法分析N末端8个氨基酸。结果重组菌株在甲醇诱导下,SDS-PAGE分析可见相对分子质量32000的特异性条带,重组蛋白占上清液总蛋白的67%;发酵液经硫酸铵沉淀、疏水和阳离子交换层析后,目的蛋白总回收率为32.4%。MTT法检测结果表明,重组MAP30蛋白具有明显的抑制人胃癌细胞SGC7901的活性,IC50为30μg/ml。N端的8个氨基酸测序进一步证实与理论一致。结论重组MAP30蛋白在毕赤酵母中正确表达,表达产物具有抑制肿瘤细胞的活性。
- 朱振洪杨威威葛立军万海同
- 关键词：苦瓜毕赤酵母基因表达
- 苦瓜MAP30基因的毕赤酵母表达载体构建及重组菌株的筛选被引量：1
- 2010年
- 目的:从苦瓜中克隆MAP30全长基因,并将该基因连接至表达载体pPIC9中,建立酵母菌落PCR筛选方法。方法采用改良SDS法从苦瓜表皮中提取基因组DNA,设计特异性的引物,通过PCR技术扩增出全长861bp的MAP30基因。该基因经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,连接至毕赤酵母表达载体pPIC9中。重组载体转化GS115菌株,运用菌落PCR鉴定重组菌株。结果:基因测序表明,该基因已成功插入酵母表达载体pPIC9α-factor分泌信号下游,同源性分析表明该基因与GeneBank(AF284811)的核苷酸同源性达99.9%,氨基酸同源性达100%。菌落PCR显示外源基因已整合入酵母GS115菌株中。结论:成功地克隆了MAP30全长基因,并构建了含MAP30基因的重组毕赤酵母表达载体,并获得了整合菌株,为下一步研究奠定了基础。
- 杨威威沈晓晓郑珍珍朱振洪
- 关键词：苦瓜毕赤酵母
- 不同方法建立的人大细胞肺癌裸鼠移植瘤模型的生物学特点被引量：7
- 2012年
- 目的比较三种常用的皮下移植瘤造模方法建立的人大细胞肺癌NCI-H460裸鼠移植瘤模型的不同生物学特点,为不同的研究寻找合适的造模方法提供实验依据。方法分别用NCI-H460细胞,NCI-H460移植瘤组织块和移植瘤匀浆液对于BALB/c-nu/nu裸鼠建立皮下移植瘤模型,运用一般生物学指标观察三种移植瘤的成瘤率、瘤重、倍增时间和组织形态;采用全自动生化分析仪检测其外周血中丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、血糖(G1u)、尿素氮(BUN)和肌酐(CREA)等生化指标;利用血球分析仪检测白细胞总数(WBC)并进行分类,最后体外对其腹腔巨噬细胞吞噬活性和NK细胞活性进行了考察。结果本实验中细胞法和匀浆法的成瘤率及肿瘤生长速率显著高于埋块法且其生长更为均一,差异较小。接种5周后,与正常裸鼠比较,三组荷瘤小鼠血液中ALT、AST显著升高,BUN、CREA显著降低,埋块组的AST和BUN两项指标显著高于其他两荷瘤组。此外,接种2周后,荷瘤裸鼠的GLU显著低于正常裸鼠,匀浆液组的GLU降得最低。白细胞中,三种方法组荷瘤小鼠血液中LYM%、MN%、HGB均有降低,匀浆液组和细胞培养组的荷瘤小鼠血液中WBC、NEUT%、PLT显著高于埋块组。免疫细胞活性方面,两种细胞均呈现出正常细胞组>匀浆组>细胞组>埋块组的趋势。结论细胞培养法接种数量可控,肿瘤生长均匀,适合建立不同实验需求的移植瘤模型,组织块移植法适于建立中药抗肿瘤筛选的动物模型,而匀浆液移植法则不推荐使用。裸鼠的生理生化状态和免疫功能与肿瘤的生长有密切的关系。
- 屠珏陈方明周卫民潘颖颖朱科燕凌云陈民利
- 关键词：裸鼠移植瘤模型血液生化白细胞分类NK细胞
