国家自然科学基金(30570554)
- 作品数：3 被引量：6H指数：2
- 相关作者：陈娟肖卫东喻爱喜金光耀周洁更多>>
- 相关机构：华中科技大学武汉大学更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- Rho激酶在体外神经元缺氧及再灌注损伤中的作用被引量：3
- 2009年
- 目的观察Rho激酶（ROK）及下游底物肌球蛋白轻链（MLC）在体外培养的神经元缺血及再灌注过程中的变化，探讨ROK在神经元受损后轴突萎缩中的作用和机制。方法培养N2a细胞并分为对照组、缺氧组、再灌注组、Y-27632干预缺氧组和Y-27632干预再灌注组共5组，Westernblot检测ROCKI和ROCKII蛋白的表达以及ROK下游MLC的磷酸化水平；噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞活力；FITC标记的鬼笔毒环肽（phalloidin）染色神经元纤维状肌动蛋白（F－aetin）骨架，免疫荧光观察轴突细胞骨架重组变化。结果N2a细胞缺氧和再灌注损伤过程中ROCKII的表达分别升高了29．7％和57．4％，而磷酸化MLC（p-MLC）的表达分别升高了21．5％和49．3％，免疫荧光镜下观察正常N2a细胞轴突、树突形态清晰，纤维状肌动蛋白丝主要分布于细胞周边，应力纤维少，而经历缺氧和再灌注损伤的N2a细胞胞浆内应力纤维增多，周边肌动蛋白丝带模糊，同时轴突回缩，MTT提示细胞增殖率低于阴性对照，分别下降了22．7％和45．6％；加入浓度为30mol／L的Rho激酶抑制剂Y-27632的N2a则无此反应，且在再灌注过程中干预可使轴突已回缩的N2a重新出现丝状伪足，MTT提示加入Y-27632能显著提高N2a细胞缺氧及再灌注损伤24h后的存活率（P〈0．05）。结论神经元在经历缺氧及再灌注过程中ROCKII激活并导致轴突内MLC过度磷酸化，这可能是致使轴突内肌动蛋白细胞骨架重组而最终导致生长锥的塌陷和神经突起的回缩的主要机制；对ROK进行抑制则可以预防或逆转这一过程。
- 肖卫东喻爱喜陈娟
- 关键词：RHO激酶再灌注损伤神经元肌动蛋白
- 截断型载脂蛋白E4对培养神经元细胞中神经细丝磷酸化的影响(英文)被引量：2
- 2006年
- 背景:神经细丝的磷酸化程度与阿尔茨海默病的发生密切相关,载脂蛋白E4是阿尔茨海默病公认的易患因子,但载脂蛋白E4对神经元细胞内神经细丝磷酸化的影响及机制尚不十分清楚。研究显示在阿尔茨海默病患者脑组织和体外培养的神经元细胞中,载脂蛋白E4蛋白C末端的272～299位氨基酸残基可被水解截去,产生truncated-apoE4片段,且与阿尔茨海默病的特征性病理改变神经纤维缠结中的磷酸化神经细丝相互作用。目的:在细胞水平观察truncated-ApoE4过度表达对培养的神经元中神经细丝磷酸化的影响。设计:非随机对照实验观察。单位:华中科技大学同济医学院基础医学院生物化学与分子生物学系。材料:实验于2005/12在华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学实验室完成。小鼠成神经瘤贴壁生长细胞株N2a由许华熙博士提供。方法:构建pEGFP-T-apoE4真核表达重组体,采用脂质体介导的方法分别将pEGFP-c3、pEGFP-apoE4和pEGFP鄄T-apoE4瞬时转染小鼠成神经瘤细胞株(N2a),24～48h后,免疫印迹技术检测神经细丝的磷酸化状态,测定糖原合酶激酶3、细胞周期依赖性蛋白激酶5(CDK5)的活性。主要观察指标:神经细丝的磷酸化程度及糖原合酶激酶3、细胞周期依赖性蛋白激酶5的酶活性。结果:转染组细胞内磷酸化神经细丝含量显著增多,糖原合酶激酶3酶活性显著增加,以pEGFP-T-apoE4转染组最为显著(P<0.05),细胞周期依赖性蛋白激酶5酶活性与对照组相比差异无显著性意义(P>0.05)。结论押Truncated鄄ApoE4过度表达可通过激活糖原合酶激酶3而非细胞周期依赖性蛋白激酶5引起成神经瘤细胞株(N2a)细胞中神经细丝过度磷酸化,提示truncated鄄ApoE4可能参与了阿尔茨海默病的病理过程。
- 周洁陈娟肖志宏金光耀冯友梅
- 关键词：载脂蛋白E类糖原合酶激酶3细胞周期蛋白质依赖激酶类
- 大鼠脊髓损伤及N2a细胞株缺氧后Rho-ROCK通路的变化被引量：1
- 2009年
- 目的观察脊髓损伤（SCI）后RhoA活性变化和体外模拟脊髓缺血再灌注诱导的神经元损伤中Rho激酶（ROCK）下游底物肌动蛋白（F-actin）细胞骨架的重组，探讨ROCK通路对于SCI后轴突萎陷的作用机制。方法成年sD大鼠Allen’s制模，Westernblot检测RhoA蛋白表达，GSTPulldownassay RhoA活性变化；培养N2a细胞，置于含90％N2的37℃培养箱中模拟脊髓继发损伤中缺血缺氧和再灌注过程，MTT检测细胞活力，并用FITC标记的鬼笔毒环肽染色神经元F-actin，免疫荧光观察其重组。结果SCI后RhoA总蛋白表达无明显变化（P〉0．05），但活性逐步增高（P〈0．05）；正常N2a细胞F-actin主要分布于细胞周边，应力纤维少，缺氧后胞质周边肌动蛋白丝带模糊，轴突回缩，胞质内应力纤维增多；而加入Y-27632的N2a缺氧后无此过程，且缺氧后再加入Y-27632亦可明显逆转此过程；MTT显示Y-27632能显著提高N2a缺氧和再灌注24h后的存活率（P〈0．05），且保护作用在一定范围内和浓度成正比。结论SCI后神经元轴突中RhoA的活性增高并过度激活ROCK，影响轴突内F—actin细胞骨架的重组，从而导致生长锥萎陷和轴突回缩；对ROCK进行抑制可以预防轴突塌陷和神经元死亡，促进轴突再生。
- 肖卫东陈娟易成腊喻爱喜陶圣祥
- 关键词：RHO/RHO激酶脊髓损伤细胞骨架
