陕西省科技攻关计划(2004k11-G3)
- 作品数：5 被引量：8H指数：3
- 相关作者：宋丽萍邱曙东李跃萍王爱英黄辰更多>>
- 相关机构：西安交通大学医学院第一附属医院西安交通大学更多>>
- 发文基金：陕西省科技攻关计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- NT4p53(N15)Ant融合基因重组腺病毒的构建及其体外抑瘤作用被引量：1
- 2008年
- 背景与目的:有研究发现P53氨基端15肽与穿膜肽(antennapedia,Ant)的融合肽能迅速穿透细胞膜,直接、快速引起乳腺癌、胰腺癌细胞坏死而非凋亡,但对正常细胞几乎没有毒性。本研究构建缺陷型腺病毒载体表达NT4p53(N15)Ant融合基因,研究其体外抑瘤作用。方法:应用Ad-EasyTM系统,在大肠杆菌同源重组,构建NT4p53(N15)Ant腺病毒表达载体,在HEK-293细胞内成功包装并鉴定后,感染肝癌细胞株HepG2,用倒置相差显微镜、透射电镜观察细胞形态学变化、四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色实验及培养基中的乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)测定研究其体外抑瘤作用。结果:Ad-NT4p53(N15)Ant对肝癌细胞株HepG2有明显抑制作用,48、72、96h细胞存活率分别为36.67%、20.47%、17.82%,与空病毒处理组比较差异有统计学意义(P<0.05);电镜观察到感染的HepG2细胞胞膜、核膜破坏,胞浆内出现囊泡状物质,染色质聚集。Ad-NT4p53(N15)Ant处理HepG2细胞24、48、72、96h时培养液中LDH释放分别为94、236、267、313U/L,较空病毒处理组明显增加,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论:构建的腺病毒载体Ad-NT4p53(N15)Ant感染HepG2细胞后能抑制细胞增殖。
- 宋丽萍李跃萍邱曙东黄辰王爱英李围围
- 关键词：腺病毒载体肿瘤基因治疗
- P53-mdm2相互作用与肿瘤治疗策略被引量：2
- 2005年
- mdm2是P53肿瘤抑制功能的主要调节者,两者之间存在自动调节的负反馈环,mdm2可通过与P53结合促进其降解。由诸多因素造成的mdm2-p53相互关系失衡所带来的直接后果就是导致p53的失活而引起肿瘤的发生。已证明有3种翻译后修饰：磷酸化、寡聚化及与其它蛋白的结合影响着mdm2、P53蛋白复合物的形成。干扰两者的结合,使P53发挥转录活性是抗肿瘤的关键。mdm2和P53蛋白相互作用抑制剂的研究是抗肿瘤治疗的一个新靶点,有广阔的应用前景。
- 宋丽萍邱曙东
- 关键词：P53MDM2肿瘤治疗
- NT4-p53(N15)-Ant融合基因重组腺病毒的构建与鉴定被引量：3
- 2006年
- 目的:构建编码融合基因NT4-p53(N15)-Ant的重组腺病毒表达载体,为进一步基因治疗的实验研究奠定基础。方法:利用PCR体系延伸互为模板的引物,通过T载体克隆法获得p53(N15)-Ant基因克隆,酶切后连入pBV220/NT4质粒,再将融合基因NT4-p53(N15)-Ant亚克隆至腺病毒的穿梭质粒内,与辅助质粒PJM17共同转染HEK-293细胞,通过同源重组获得重组腺病毒Ad.NT4-p53(N15)-Ant,收集病毒上清,大量扩增并测定其滴度,用RT-PCR检测目的基因在293细胞的表达情况。MTT比色法观察重组病毒对HepG2细胞存活率的影响。结果:克隆出p53(N15)-Ant基因,经酶切及测序证实结果正确;得到高滴度的(1×1011pfu/ml)重组腺病毒表达载体;反转录聚合酶链反应证实感染Ad.NT4-p53(N15)-Ant的293细胞中有目的基因的表达。Ad.NT4-p53(N15)-Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤作用,与Ad.GFP比较,NT4p53(N15)Ant重组腺病毒处理组HepG2细胞的存活率明显降低。结论:通过分子克隆体外重组技术成功制备了NT4-p53(N15)-Ant复制缺陷型重组腺病毒,为下一步的肿瘤基因治疗奠定了基础。
- 宋丽萍李跃萍邱曙东杨广笑王全颖
- 关键词：重组腺病毒肿瘤基因治疗
- NT4-p53(N15)-Ant融合基因的克隆和鉴定被引量：4
- 2006年
- 目的构建NT4-p53(N15)-Ant融合基因表达盒并进行序列分析。方法应用互为模板的引物PCR技术及T载体克隆法克隆p53(N15)-Ant基因,筛选阳性克隆、酶切鉴定并测序。扩增阳性重组质粒后限制性内切酶切取p53(N15)-Ant片段连入pBV220/NT4质粒。结果克隆了p53(N15)-Ant基因,经酶切及测序证实结果正确;重组质粒pBV220/NT4p53(N15)Ant经限制性内切酶及琼脂糖凝胶电泳,结果显示酶切片段大小和理论值一致。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了含有NT4-p53(N15)-Ant表达盒的pBV220质粒,为进一步开展肿瘤的基因治疗奠定了基础。
- 宋丽萍李跃萍邱曙东杨广笑王全颖
- 关键词：基因克隆肿瘤
- 腺病毒介导的NT4p53(N15)Ant异源融合基因对肝癌细胞的杀伤作用被引量：3
- 2007年
- 目的构建包括神经营养因子4(NT4)信号肽,p53氨基端短活性肽(12～26位氨基酸)及蛋白质转导结构域-黑腹果蝇触足肽(Ant)序列在内的异源融合基因,并以腺病毒作为基因转移载体观察NT4p53(N15)Ant基因在体外对肝癌细胞系HepG2的杀伤效应。方法应用互为模板的引物PCR技术及T载体克隆法获得p53(N15)Ant基因克隆,经酶切后连入pBV220/NT4质粒,再将融合基因NT4p53(N15)Ant亚克隆至腺病毒的穿梭质粒内,与辅助质粒pJM17共转染HEK293细胞,通过同源重组获得重组腺病毒,经PCR鉴定后,NT4p53(N15)Ant重组腺病毒感染HepG2细胞,用MTT比色法和PI染色流式细胞计数仪分析Ad.NT4p53(N15)Ant对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤效应及凋亡率。结果克隆出NT4p53(N15)Ant基因,得到高滴度的重组腺病毒,提取病毒DNA经PCR证实含目的基因。MTT测定结果显示,与平行对照病毒Ad.GFP相比,Ad.NT4p53(N15)Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤效应,且以病毒感染后48h作用最为明显,对肿瘤细胞抑制率达到63.3%,而对正常细胞NIH3T3的影响很小。Ad.NT4p53(N15)Ant感染HepG2细胞30h后的流式细胞仪分析结果显示:Ad.NT4p53(N15)Ant可使HepG2细胞发生凋亡,凋亡率为18.16%。结论通过分子克隆体外重组技术我们首次成功制备了NT4p53(N15)Ant复制缺陷型重组腺病毒;初步的研究发现Ad.NT4p53(N15)Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤效应,这种效应部分是通过诱导HepG2细胞的凋亡而实现的。
- 李跃萍邱曙东宋丽萍王全颖杨广笑
- 关键词：腺病毒载体HEPG2细胞
