国家教育部博士点基金(20126401110001)
- 作品数：10 被引量：14H指数：3
- 相关作者：石德顺李湘萍李胜何金娜雷薇更多>>
- 相关机构：广西大学宁夏大学襄阳职业技术学院更多>>
- 发文基金：国家教育部博士点基金广西壮族自治区自然科学基金国家重点实验室开放基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 结核分枝杆菌Ag85A和Ag85B基因真核共表达载体的构建与表达(英文)
- 2013年
- 目的 Ag85A和Ag85B是结核分枝杆菌的主要优势保护抗原,为提高编码Ag85A和Ag85BDNA疫苗的免疫性和免疫效果,特构建真核共表达Ag85A和Ag85B抗原的真核表达载体pcDNA-Ag85A-IRES-Ag85B,并利用293T细胞其表达进行检测。方法 PCR扩增Ag85A和Ag85B基因,逐步将Ag85A和Ag85B基因定向插入至质粒pcDNA3.1(+)克隆位点CMV启动子与加A信号BGH poly(A)之间,并将Ag85A和Ag85B基因以内部核糖体进入位点(internal riboome entry site,IRES)序列连接,酶切和测序验证后将重组质粒转染至293T细胞中进行真核表达,48h后提取细胞总蛋白,达产物经SDS-PAGE分离和Western blot分析。结果限制性内切酶酶切及测序结果表明,重组质粒pcDNA-Ag85ARES-Ag85B基因序列和阅读框架正确。将重组质粒转入293T细胞后,利用Ag85A和Ag85B特异性抗体Western blot检测实两种抗原可在同一载体中各自独立表达。结论成功构建了能够同时独立表达结核分枝杆菌Ag85A和Ag85B抗原基的真核表达载体pcDNA-Ag85A-IRES-Ag85B,为下一步研究它们的免疫原性和免疫效果奠定了基础。
- 李武邓光存刘晓明王玉炯
- 关键词：结核分枝杆菌AG85AAG85B共表达WESTERNBLOT
- 乳腺组织染色质免疫共沉淀方法的改进
- 2014年
- 作为研究基因表达调控的重要方法,近年来染色质免疫共沉淀(ChIP)得到了越来越广泛的应用,但有关将乳腺组织作为ChIP材料的研究及其方法尚未见报道。采用传统的组织ChIP试剂盒处理乳腺组织时,存在样品回收率低、乳脂/乳蛋白影响杂交效率和超声积热等问题,针对以上问题对乳腺组织ChIP方法进行改进。新方法省略组织均一化步骤、用酶切-超声法代替超声法进行染色质片段化、在细胞裂解和酶切步骤间增加洗涤步骤。结果显示,与脾脏组织相比,乳腺组织不适合进行组织均一化处理。酶切-超声法比超声法更适于对乳腺组织进行染色质片段化。采用改进后的ChIP方法获得的DNA样品中,靶序列得到显著的富集,所得的DNA样品能够满足测序(ChIP-Seq)要求。结果说明,改进后的方法适用于乳腺组织染色质免疫共沉淀,并为研究乳腺组织基因表达调控奠定了基础。
- 任艳萍罗婵黄章虎黄时海石德顺李湘萍
- 关键词：表观遗传学CHIP乳腺NUCLEASE
- 水牛水通道蛋白9基因克隆及其表达分析被引量：3
- 2015年
- 本研究旨在对水牛水通道蛋白9(aquaporins 9,AQP9)基因进行克隆,并对其在水牛不同组织中的表达规律及其在水牛卵巢和睾丸组织中的表达差异进行探索。根据GenBank上黄牛AQP9基因序列(登录号:NM_001205833.1)设计特异性引物,以水牛睾丸组织cDNA为模板,应用RT-PCR方法扩增AQP9基因编码区片段;运用生物信息学方法分析其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质;应用实时荧光定量PCR技术分析AQP9基因在水牛组织中的表达情况;免疫组织化学方法分析AQP9蛋白在不同发育阶段水牛卵泡及睾丸组织中的表达差异。结果表明,克隆获得了888bp的水牛AQP9基因编码区序列,其编码295个氨基酸。多重序列比较显示,水牛AQP9核苷酸序列与牛、猪、绵羊和人相应序列相似性分别为99%、90%、97%、88%;氨基酸序列的同源性分别为99%、86%、97%、83%,系统进化树分析结果推测,AQP9基因在物种进化过程中具有高度保守性。实时荧光定量PCR结果显示,AQP9基因在水牛肝脏、肺脏、大脑、皮肤、睾丸和卵巢组织中有不同程度的表达,在肝脏组织中表达最高,皮肤和睾丸次之,肺脏和卵巢表达较低。免疫组化结果显示,在卵巢组织中,AQP9蛋白表达随卵泡发育时期的不同而变化,并随着卵泡发育其表达逐渐增强;在睾丸组织中,AQP9蛋白在各级精母细胞和间质细胞中均有表达。结果提示,成功克隆得到水牛AQP9基因序列;AQP9在水牛卵巢和睾丸中的表达及其功能可能与水牛卵泡发育和精子发生有重要的关联。
- 屈春凤李胜李卉杜凤娇雷薇吴柱连李湘萍石德顺
- 关键词：水牛克隆
- 小鼠胚胎DNA氧化损伤模型的建立被引量：2
- 2015年
- 为了研究胚胎DNA损伤修复机制,试验以H2O2为DNA损伤诱导剂,建立小鼠胚胎DNA氧化损伤模型,采用不同浓度H2O2培养小鼠受精卵,观察其对小鼠胚胎发育能力的影响;再通过免疫荧光方法检测γH2AX和ρATM蛋白的表达状况,以判断H2O2处理所导致的胚胎DNA损伤情况及较适宜的诱导条件。结果表明：1.5~2.4μmol/L H2O2处理对小鼠胚胎发育能力具有影响,与KOSM（-）对照组相比,H2O2处理组小鼠胚胎的分裂率、囊胚率呈下降趋势,其中1.8~2.4μmol/L H2O2处理组的胚胎分裂率、囊胚率呈显著下降趋势（P〈0.05）。免疫荧光法检测发现KOSM（-）对照组中,2-细胞期胚胎的γH2AX焦点数多于1-细胞期胚胎,ρATM在两个时期的胚胎中未检测到。γH2AX和ρATM在1.5,1.8μmol/L H2O2处理组的1-细胞期胚胎中均未检测到;2-细胞期胚胎表达γH2AX,未检测到ρATM。2.1,2.4μmol/L H2O2处理组的1-细胞和2-细胞期胚胎均有γH2AX和ρATM表达,其中2.4μmol/L H2O2处理组两个时期胚胎的γH2AX焦点数多于2.1μmol/L H2O2处理组。说明1.5~2.4μmol/L H2O2处理会影响小鼠胚胎体外发育能力,2.1,2.4μmol/L H2O2处理可诱导小鼠胚胎发生DNA双链断裂现象。
- 何金娜李胜沈开元王萍石德顺李湘萍
- 关键词：小鼠胚胎DNA氧化损伤H2O2
- 水通道蛋白在哺乳动物卵泡发育过程中作用的研究进展
- 2015年
- 水通道蛋白(AQPs)是一类分布广泛的能促进水转运的小分子跨膜蛋白家族。作为细胞膜表面通道分子,水通道蛋白不仅对小分子类物质及水等有运输作用,还广泛参与哺乳动物生殖细胞发生及生殖调控等重要过程。研究发现,在哺乳动物卵泡发育过程中,卵泡形成和成熟、卵泡液的转运、窦腔形成、卵泡闭锁等均与水通道蛋白基因的表达及调节密切相关。文章对水通道蛋白基因及其在哺乳动物卵泡发育中的作用进行综述,并就其在卵泡发育及闭锁机制方面提出设想。
- 李胜屈春凤何金娜石德顺李湘萍
- 关键词：卵泡发育颗粒细胞雌激素
- 鄂西黑猪和杜洛克×太湖猪杂交猪的育肥对比试验被引量：1
- 2015年
- 为了探索黑猪生产的最佳经济效益和社会效益,对地方黑猪(鄂西黑猪)和杜洛克×太湖猪杂交猪进行了育肥对比试验。通过效益分析,鄂西黑猪头均盈利为-118.28元,杜洛克×太湖猪杂交猪头均盈利为376.23元。从而表明:在黑猪生产上,饲养杂交改良型黑猪的产出效益明显高于地方黑猪。
- 杜俊成杨莎王传定王露
- 结核分枝杆菌CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85B抗原真核共表达载体的构建与表达被引量：3
- 2014年
- CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85B是结核分枝杆菌的主要免疫优势抗原。为了构建一种可同时表达这4种抗原的真核多基因共表达载体pcDNA-CFP10-ESAT6-Ag85A-Ag85B(pcDNA-CEAB),并利用HEK 293T细胞对其体外表达进行检测。采用酶切、连接的方法,将CFP10和ESAT6编码基因以(Gly4Ser)3蛋白Linker连接,插入至质粒pcDNA3.1(+)多克隆位点CMV启动子与加尾信号BGH pA之间,使两者融合表达,将Ag85A和Ag85B编码基因以内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site,IRES)序列连接,并赋予RSV启动子和加尾信号BGH pA,使两者在RSV启动子作用下独立表达。重组质粒经酶切及测序验证后转染至HEK 293T细胞中进行体外表达实验,48 h后提取总蛋白,利用CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85B特异性抗体进行Western blotting检测。结果显示多基因共表达载体pcDNA-CEAB在真核细胞HEK 293T中得到表达,且CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85B抗原能被相应的特异性抗体所识别,表明质粒pcDNA-CEAB构建正确,这为进一步研究其免疫原性和免疫保护效果奠定了基础。
- 李武邓光存刘晓明王玉炯
- 关键词：结核分枝杆菌蛋白免疫印迹
- 水牛水通道蛋白8基因克隆及表达分析被引量：4
- 2014年
- 本研究对水牛水通道蛋白8(aquaporin 8,AQP8)基因进行了克隆,并构建了真核表达载体,同时对AQP8基因在水牛卵巢组织中的表达进行了分析。结果发现,水牛AQP8基因编码区长度为732bp,与黄牛及小鼠AQP8基因的氨基酸序列同源性为100%。AQP8蛋白在不同发育阶段水牛卵泡中均有表达,在次级卵泡中的表达显著高于原始卵泡和初级卵泡(P<0.05),且集中表达于卵泡颗粒细胞。构建的pEGFP-N1-AQP8真核蛋白融合表达载体经脂质体法转染HEK293T细胞后,可观察到清晰的EGFP绿色荧光蛋白表达。该试验结果为深入研究AQP8基因在水牛卵泡发育及颗粒细胞凋亡中的功能奠定了基础。
- 李胜屈春凤李润何金娜石德顺李湘萍
- 关键词：水牛水通道蛋白8卵泡颗粒细胞
- 哺乳动物卵母细胞及早期胚胎蛋白质组学研究进展被引量：1
- 2014年
- 雌性生殖细胞发育是动物繁殖的基石,哺乳动物卵母细胞和早期胚胎在其生长发育过程中有许多独特的现象和规律,涉及一系列蛋白质合成/降解和磷酸化等状态的动态改变。对卵母细胞分裂、成熟调控机理以及植入前胚胎发育规律的研究是发育生物学领域的一项重要课题。蛋白质组学是以细胞或组织内全部的蛋白质为研究对象,系统鉴定、定量蛋白质并研究这些蛋白质功能的科学。随着蛋白质分离、鉴定技术的快速发展,蛋白质组学为卵母细胞发生、分化、成熟以及质量控制等相关研究提供了新的方法和内容,如在蛋白质定量、修饰、定位和相互作用等方面提供其他组学技术不可获得的重要信息。这些信息将有助于揭示哺乳动物卵母细胞成熟和早期胚胎发育的分子机制,对于进一步完善卵母细胞的体外成熟培养体系,提高胚胎体外生产、体细胞克隆和转基因动物生产效率具有重要意义。
- 陈凌声徐平石德顺李湘萍
- 关键词：蛋白质组学哺乳动物卵母细胞减数分裂
- RAD18基因在小鼠胚胎中的表达分析被引量：1
- 2015年
- 为了研究RAD18基因在小鼠胚胎发育过程中的表达模式,试验以体外培养的FVB小鼠胚胎为材料,采用定量RT-PCR及免疫荧光技术分析RAD18基因在小鼠胚胎中的表达水平。qRT-PCR结果表明,RAD18基因在小鼠植入前各时期胚胎中均有表达,其中与1-细胞期胚胎相比,其在2-细胞、8-细胞期胚胎中表达水平较高(P<0.01),在桑葚期和囊胚期胚胎中表达量显著下降(P<0.01)。免疫荧光方法检测结果表明RAD18蛋白在在小鼠植入前各时期胚胎中均有表达。说明RAD18基因在小鼠植入前胚胎中均有表达,推测其与小鼠胚胎的早期发育密切相关。
- 何金娜李胜雷薇石德顺李湘萍
- 关键词：胚胎发育基因表达
