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鸡胚发育早期Sonic Hedgehog在脊髓中的异位表达对形态结构及相关蛋白表达的影响: 2014年; 该文主要分析音猬因子（Sonic Hedgehog,Shh）在鸡胚发育过程中对脊髓形态结构的形成和相关蛋白表达的影响。实验过程采用鸡胚带壳开窗培养技术,待胚胎发育至第3 d,将2μg/μL pCAGGS-Shh和0.25μg/μL pCAGGS-GFP质粒以1：8浓度混合,将0.1~0.5μL混合液准确地注射到神经管,在电压18 V、每次脉冲60 ms、间隔100 ms、电脉冲6次的条件下进行定时定位活体电转基因,电转后6 h开始到5 d分别收集胚胎,冰冻切片,采用荧光免疫组化和DAPI染色观察组织形态结构及相关蛋白的变化。结果表明,电转后6 h便可以观察到GFP的表达,24 h时Shh在脊髓中的异位表达能够诱导转录因子Nkx2.2（NK2 homeobox 2）的表达,并且能够抑制Pax7（paired-type homeobox 7）的表达,而Shh异位表达时脊髓的结构发生了明显的改变;说明Shh作为脊髓发育过程重要的信号分子,其异位表达能够诱导和抑制相关蛋白的表达,影响脊髓正常发育。; 李小英杨慈清王聪睿付苏雷李晗林俊堂; 关键词：鸡胚脊髓

鸡胚发育过程敲减神经型钙黏蛋白表达对视顶盖神经元迁移及神经丝蛋白的影响被引量：2: 2013年; 目的阐明鸡胚发育过程神经型钙黏蛋白（N-cadherin）在中枢神经系统中的作用及其对神经丝蛋白（NF）表达的影响。方法鸡胚正常培养到第3天（E3），采用鸡胚带壳开窗培养方法，取出3～4ml蛋清，开窗培养至E5，将N-cadherin干扰载体pGPU6-GFP-neo-N-cadherin-shRNA通过活体电转基因技术导入视顶盖，电转后继续培养到E12，每组收集3个胚胎，取材，固定，包埋，切片后进行荧光免疫组织化学分析相关蛋白的表达。结果鸡胚发育过程，敲减N-cadherin表达影响神经元迁移，被敲减的细胞主要停留在室管膜区，在N-cadherin受到抑制表达的区域，NF的表达也受到抑制，其表达明显减弱。结论 N-cadherin的抑制表达可导致神经元的迁移发生紊乱，影响NF的表达。; 杨慈清李琼付苏雷李晗范义峰郭志坤林俊堂; 关键词：视顶盖神经丝蛋白鸡胚

小鼠子宫内电转基因方法的建立被引量：1: 2013年; 目的：建立小鼠子宫内电转基因技术，比较分析转染绿色荧光蛋白（GFP）后对胚胎发育及相关蛋白表达的影响。方法：将怀孕15d的小鼠，水合氯醛麻醉后，取出两侧子宫，用毛细管注射针将2μg／μl的pCAGGS-GFP质粒0．5-1μl准确注射到胎鼠侧脑室，在电压40V、每次脉冲60ms，间隔940ms，电脉冲6次的条件下进行定时定位活体电转基因，电转后24h取材，甲醛固定冷冻冠状切片，DAPI染细胞核观察组织形态结构变化，荧光免疫组织化学检测α-SMA的表达差异。结果：妊娠15d孕鼠转染24h后小鼠成活率80％（8／10），胚胎成活率为54．2％（13／24），存活胚胎GFP阳性表达率为61．5％（8／13），GFP阳性表达胚胎脑组织切片，基因转染区域和正常组织区组织形态结构和α-SMA表达不存在差别。结论：成功建立了小鼠子宫内电转基因的方法。; 杨慈清李小英卢习付苏雷赵善廷林俊堂; 关键词：小鼠转基因方法

鸡胚培养及活体电转基因方法的建立被引量：8: 2012年; 目的建立和优化鸡胚胎带壳培养(in ovo culture)、去壳培养(ex ovo culture)和活体原位电转基因(in vivo electroporation)等技术。方法鸡胚孵化第2～3天,带壳培养至2～3 d和去壳培养至5～6d,分别在脊髓和大脑视顶部位,在电压18V、电流60mA、间隔90ms和电脉冲6次(60ms/次)的条件下进行定时定位活体电转基因。结果带壳和去壳培养样本数分别为20个和10个,成活率分别是85%和80%,胚胎发育至2～3 d和5～6 d在脊髓和视顶部位转染样本数分别为11个和10个,阳性表达率为54.5%和60%。结论成功建立和优化了鸡胚培养和活体定时定位电转基因的方法。; 杨慈清毛会丽林俊堂; 关键词：发育鸡胚

鸡原钙黏蛋白17胞内部分肽段的异源表达及多克隆抗体的制备: 2013年; 原钙黏蛋白（protocadherins，Pcdh）是一种带有亲同种抗原黏附活性的跨膜蛋白，目前已经发现大约有60多种Pcdh在大脑中表达。Pcdh分子不仅可以作为黏附分子加强神经突触的连接，还可作为受体在信号转导过程中起作用。此外，Pcdh还参与细胞迁移和细胞分选、神经元同路和神经突触的建市以及细胞存活和细胞，{三长抑制。一些pcdh基因的突变与人类疾病联系密切。例如，pcdhl2的缺失会导致动脉管壁的结构和功能发生改变，pcdhl7的表达沉默会导致Pcdhl7的肿瘤抑制活性消失。; 李永海赵兴华李萌林俊堂; 关键词：钙黏蛋白多克隆抗体异源表达肽段胞内神经突触

小鼠胚胎发育过程中N-Cadherin异常表达对大脑皮层神经元迁移的影响被引量：3: 2013年; 目的:探究N-Cadherin异常表达对小鼠大脑皮层发育过程中神经元迁移的影响。方法:通过小鼠活体子宫电转基因技术和RNA干扰技术相结合,在小鼠胚胎大脑皮层发育过程中实现对N-Cadherin的超表达和抑制表达,荧光免疫组化检测超表达结果,用GFP示踪N-Cadherin超表达和抑制表达后神经元在大脑皮层发育过程中的迁移特征。结果:与对照组相比,N-Cadherin超表达后有更多的GFP阳性神经元迁移到皮层的Ⅱ-Ⅳ层;N-Cadherin被抑制后大量GFP阳性神经元停滞在SVZ区。结论:N-Cadherin在小鼠大脑皮层发育过程中对神经元的迁移具有影响作用。; 付苏雷杨慈清贾阳阳李晗郭志坤林俊堂; 关键词：神经元迁移 RNA干扰

ADAM17异常表达对神经前体细胞迁移的影响: 2014年; 目的：分析在胚胎发育过程ADAM17异常表达对神经前体细胞迁移的影响。方法：采用鸡胚活体电转和小鼠子宫内电转基因技术,在鸡胚发育的第5 d（E5）,将2μg/μl的p CAGGS-ADAM17和0.25μg/μl的p CAGGS-GFP质粒以1∶8混合液0.25-0.5μl准确地注射到视顶盖内,然后电转基因,E12时收集胚胎;小鼠胚胎发育的15 d（E15）进行子宫内电转,将2μg/μl的shRNA-ADAM17和0.25μg/μl的p CAGGS-GFP质粒以1∶8混合液0.25-0.5μl准确地注射到一侧脑室,电转基因后E20时收集胚胎。冰冻切片,采用免疫荧光组织化学和DAPI染色观察组织形态结构及相关蛋白的变化。结果：在鸡胚模型中,ADAM17的超表达并不会明显的引起神经前体细胞迁移的改变,对细胞核转录因子Pax7的表达也没有影响;在鼠胚模型中,ADAM17的抑制表达能够引起神经前体细胞迁移受阻,但并没有引起大脑皮层各层的结构的变化。结论：ADAM17的抑制表达对神经前体细胞的迁移具有抑制作用,但并不会引起大脑皮层结构的改变。; 杨慈清李小英王聪睿付苏雷李晗林俊堂; 关键词：ADAM17 神经前体细胞鸡胚小鼠胚胎

一种鸡胚发育过程脊髓神经纤维投射研究方法的建立被引量：3: 2014年; 目的建立一种鸡胚发育过程脊髓神经纤维投射的研究方法。方法采用鸡胚带壳开窗培养技术,在鸡胚胚龄3d(E3),通过活体电转基因技术将携带有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒(pCAGGS-GFP)准确注射到脊髓腔进行定时定位活体电转,转染后3d在体视荧光显微镜下进行观察;取出GFP阳性表达的胚胎,剥离出脊髓,从顶板处破开之后将脊髓展开,用4%多聚甲醛固定1h后,对神经钙黏蛋白(N-cadherin)进行免疫荧光染色,用4’6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染细胞核;封片后在荧光显微镜下观察神经纤维投射情况。结果对比横向切片和脊髓展开标本,两者均观察到GFP阳性转染侧的神经元纤维穿过底板沿对侧脊髓白质区边缘投射到神经结节,在脊髓展开标本中还可观察到神经纤维穿过底板再纵向向脑部投射;而N-cadherin免疫荧光染色结果表明,GFP基因的转染对机体正常的发育无明显影响。结论本实验建立了一种鸡胚发育过程脊髓神经纤维投射的研究方法。; 胡阿珍杨慈清付苏雷贾阳阳李晗郭志坤林俊堂; 关键词：脊髓神经纤维鸡胚

原钙黏蛋白的研究现状及意义被引量：1: 2013年; 原钙黏蛋白（protocadherin，Pcdh）大约在十年前由Shintaro等在使用经典钙黏蛋白（cadhefin，Cdh）细胞外（Extracellua，EC）结构域重复序列的简并引物PCR扩增鉴定Cdh家族新成员时，意外发现了编码CdhEC域的PCR扩增产物片段，这些Cdh的EC结构域与经典Cdh的EC结构域明显不同，于是就将它们称为Pcdh。; 赵兴华李永海李萌林俊堂; 关键词：中枢神经系统细胞黏附

鸡pcdh 8基因部分片段的克隆、表达及多克隆抗体的制备: 2013年; 为了制作鸡原钙黏蛋白8(protocadherin 8,pcdh 8)的多克隆抗体,试验设计了针对pcdh 8膜外肽段相应基因的1对引物,从鸡胚的脑组织中提取总RNA,通过RT-PCR合成cDNA;然后以cD-NA为模板扩增膜内肽段对应的基因片段,测序正确后将其克隆至原核表达载体pGEX-2TK中;在大肠杆菌BL21中,以IPTG诱导表达GST-pcdh 802融合蛋白;利用Glutathione-sepharose 4B柱亲和层析纯化GST-pcdh 802融合蛋白,并采用足垫免疫的方法免疫大鼠制作多克隆抗体。结果表明:成功纯化了pcdh 8的融合蛋白,并制备出多克隆抗体,经Western-blot检测该抗体可用于鸡胚脑组织pcdh 8蛋白的表达检测。; 李永海李萌赵兴华林俊堂; 关键词：异源表达鸡胚

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