广东省自然科学基金(10151008901000117)
- 作品数：5 被引量：19H指数：4
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- 组织蛋白酶B在急性光损伤皮肤成纤维细胞中的表达及意义被引量：5
- 2014年
- 目的 探讨组织蛋白酶B（CatB）在急性光损伤人皮肤成纤维细胞（HDF）中的表达变化及意义.方法 体外培养原代HDF,选取第4～8代细胞进行实验.实验设长波紫外线（UVA）照射组和不照射的对照组.CCK8法分别检测5、10、15、20和25 J/cm2 UVA照射后HDF的增殖率.用10 J/cm2 UVA单次照射致HDF急性光损伤,Western印迹及实时定量逆转录（RT）-PCR分别检测急性光损伤组HDF及对照组HDF照射后24、48、72 h CatB蛋白及mRNA表达;另外分别用10、15、20、25 J/cm2 UVA照射HDF,Western印迹及实时定量RT-PCR分别检测急性光损伤组及对照组HDF照射后48 h CatB蛋白及基因表达.数据采用SPSS 13.0统计软件行方差分析,两组间比较采用最小显著差异法（LSD）.结果 UVA照射导致HDF增殖率下降;当UVA剂量≤10 J/cm2时,细胞存活率均保持在85％以上,各照光组分别与对照组24、48、72 h时比较,均P＜0.05.Western印迹结果显示,急性光损伤组（10 J/cm2 UVA照射）CatB蛋白灰度值在照射后24 h（0.76±0.14）、48 h（1.34±0.38）、72 h（0.82±0.09）均较对照组（分别为0.35±0.01、0.45±0.12、0.61±0.06）升高（均P＜0.05）.实时定量RT-PCR显示,在急性光损伤组CatB的mRNA表达在照射后24 h（0.149±0.009）、48 h（0.173±0.009）、72 h（0.185±0.158）也较对照组（分别为0.089±0.015、0.091±0.010、0.111±0.017）上调（均P＜0.05）.10、15、20、25 J/cm2 UVA照射HDF后48 h,CatB的蛋白灰度值分别为0.99±0.07、1.49±0.14、1.89±0.08、2.07±0.06,均较对照组（0.60±0.05）升高（均P＜0.05）,CatB的mRNA表达也较对照组升高.结论 UVA致急性光损伤的皮肤成纤维细胞中CatB蛋白及mRNA表达均上调.
- 侯巍许庆芳刘晨郑跃赖维
- 关键词：成纤维细胞紫外线组织蛋白酶B
- UVA致人皮肤成纤维细胞急性和慢性光损伤模型的建立被引量：5
- 2014年
- 目的:探讨人皮肤成纤维细胞(human dermal fibroblasts,HDFs)急性和慢性光损伤模型建立的方法。方法:体外培养原代人皮肤成纤维细胞,选取第4~8代的细胞进行实验。用长波紫外线(UVA)单次照射建立HDFs急性光损伤模型,荧光倒置显微镜观察不同剂量UVA照射后第1、2、3天HDFs的形态变化;CCK-8法检测照射后HDFs的增殖活性。慢性光损伤HDFs模型采用8-甲氧沙林(8-MOP)避光孵育细胞24h,随后以含8-MOP的磷酸盐缓冲液(PBS)置换培养基,行9J/cm^2 UVA照射,照射完成后换Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(含10%胎牛血清)避光传代培养,21d后显微镜下观察HDFs形态;衰老相关-β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色法计算衰老细胞率。结果:单次UVA照射导致HDFs增殖率下降,与UVA剂量呈正相关。UVA在剂量为≤10J/cm^2时,细胞存活率保持在>85%;而UVA剂量≥15J/cm^2时细胞存活率明显降低;≥20 J/cm^2时存活率为50%左右,至25 J/cm^2时仅为约25%。慢性光损伤HDFs诱导组(即UVA+MOP组)几乎所有细胞均出现体积变大、细胞颗粒增加等细胞老化的特征性改变;SA-β-Gal染色细胞的阳性率>95%。结论:UVA单次照射可成功建立HDFs急性光损伤模型,UVA联合8-MOP构建HDFs慢性光损伤模型。
- 侯巍郑跃许庆芳刘晨陆春赖维
- 关键词：光老化皮肤成纤维细胞
- MAPK信号通路调控长波紫外线诱导的皮肤成纤维细胞组织蛋白酶K表达被引量：5
- 2014年
- 目的 研究MAPK信号通路调控长波紫外线（UVA）诱导皮肤成纤维细胞组织蛋白酶K（CatK）的表达.方法 原代培养的皮肤成纤维细胞取自儿童包皮.Western印迹检测10 J/cm^2 UVA照射前及照射后0.75、1.5、3和6h皮肤成纤维细胞中磷酸化JNK（p-JNK）、JNK、磷酸化P38（p-P38）、P38蛋白的表达.800 nmol/L SP600125（SP）、10 μmol/L SB203580（SB）分别孵育皮肤成纤维细胞,实验分为无UVA照射的对照组、SP组、SB组及10 J/cm^2 UVA照射的对照（UVA）组、UVA-SP组、UVA-SB组.先以Western印迹检测各组UVA照射后1.5 h磷酸化c-Jun （p-c-Jun）和磷酸化MAPKAPK2 （p-MAPKAPK2）表达,再以RT-PCR和Western印迹检测各组照射后48 h CatK mRNA、蛋白的表达.结果 皮肤成纤维细胞在UVA照射后0.75、1.5 h,p-JNK表达的灰度值分别为4.77±0.19和4.68土0.09,p-P38分别为2.44±0.13、2.30±0.04,均较照射前（p-JNK为3.2±0.27,p-P38为1.61±0.08）显著升高（均P＜0.05）;而在照射后3、6h的表达与照射前相比差异无统计学意义（P＞0.05）.p-c-Jun在UVA-SP组表达（2.55±0.48）、p-MAPKAPK2在UVA-SB组表达（1.16±0.12）均显著低于UVA组（分别为4.85±0.96和2.46±0.09）,均P＜0.05.UVA-SP组、UVA-SB组CatK mRNA、蛋白的表达分别降为UVA组的38.9％、28.7％和55.7％、49.6％（P＜0.05）,UVA-SP组CatKmRNA、蛋白的表达也均显著低于UVA-SB组（P＜0.05）.结论 JNK和P38信号通路在调控UVA上调的皮肤成纤维细胞CatK表达中起重要作用.
- 许庆芳侯巍郑跃刘晨龚子鉴陆春赖维
- 关键词：成纤维细胞组织蛋白酶类MAP激酶信号系统紫外线
- UVA照射对皮肤成纤维细胞组织蛋白酶K表达的影响被引量：6
- 2013年
- 目的探讨皮肤成纤维细胞中组织蛋白酶K（Cathepsin K，CatK）的表达随UVA照射后时间及其剂量的变化。方法原代培养的皮肤成纤维细胞来自儿童包皮，10代以内的细胞行后续实验。先以10J／em2UVA照射皮肤成纤维细胞，在照射后24、48、72h提取照射组和对照组细胞蛋白和mRNA。再以10J／cm2、20J／cm2、30J／cm2UVA照射皮肤成纤维细胞，在照射后48h收集细胞。用RT—PCR和Western印迹法分别检测各组间CatKmRNA、蛋白的表达的差异。结果10J／cm2UVA照射后1、2、3d，照射组CatKmRNA表达分别为0．351±0．038（对照组0．177±0．006）、0．510±0．017（对照组0．176±0．002）、0．313±0．012（对照组0．173±0．002）。照射组CatK蛋白灰度值分别为1．76±0．27（对照组0．82±0．45）、2．97±0．36（对照组1．58±0．15）、2．23±0．14（对照组1．29±0．32），照射组CatKmRNA、蛋白表达均较对照组升高（P〈0．05），且以照射后第2天表达最高。10、20、30J／cmzUVA照射后，48h皮肤成纤维细胞中CatKmRNA表达分别为对照组的2．34、2．91、3．18倍，CatK蛋白表达分别为对照组的1．77、2．82、3．64倍，均随UVA剂量的升高而增加，其差异有统计学意义（P〈0．05）。结论CatK在UVA照射后皮肤成纤维细胞中的表达升高。
- 许庆芳侯巍刘晨郑跃龚子鉴赖维
- 关键词：成纤维细胞组织蛋白酶K紫外线
- SP600125抑制UVA激活皮肤成纤维细胞JNK通路的最佳浓度被引量：3
- 2014年
- 【目的】研究抑制UVA激活的皮肤成纤维细胞JNK通路的最佳SP600125浓度,为研究JNK信号通路在光老化中的作用机制奠定基础。【方法】原代培养取自儿童包皮的皮肤成纤维细胞。用CCK-8法结合荧光倒置显微镜研究不同剂量UVA和不同浓度SP600125及两者联合对皮肤成纤维细胞活性和形态的影响,以选择非细胞毒性的UVA剂量和SP600125浓度。再用Western-blot检测UVA辐照后不同时间点皮肤成纤维细胞中磷酸化c-Jun(P-c-Jun)表达以确定其被诱导表达的时间点。最后用Western-blot检测不同浓度SP600125对UVA上调的P-c-Jun表达的抑制。【结果】UVA和SP600125分别辐照细胞和孵育细胞时,UVA≤10 J/cm2和SP600125≤2μmol/L均能保持细胞活性在90%以上。10 J/cm2的UVA辐照不同浓度SP600125孵育的细胞时,≤800 nmol/L的SP600125孵育的细胞活性在90%以上;1μmol/L的SP600125使细胞活性明显下降至67.1%,镜下见部分细胞皱缩、碎裂、死亡;2μmol/L的SP600125使细胞活性进一步下降至7.6%,镜下见绝大部分细胞变形、碎裂、死亡。Western-blot结果显示P-c-Jun在UVA辐照后0.75 h、1.5 h均较0 h升高,3 h后恢复至0 h水平。200~800 nmol/L SP600125呈剂量依赖性地抑制UVA上调的P-c-Jun表达,差异有统计学意义。【结论】低于常用浓度的200~800 nmol/L SP600125即可抑制UVA激活的皮肤成纤维细胞的JNK通路。JNK通路可能在UVA辐照的皮肤成纤维细胞中起抗凋亡作用。
- 许庆芳侯巍郑跃刘晨龚子鉴陆春赖维
- 关键词：SP600125UVA皮肤成纤维细胞光老化
