国家自然科学基金(30970628)
- 作品数：3 被引量：15H指数：3
- 相关作者：鞠建松徐书景赵宝华何广正张彩凤更多>>
- 相关机构：河北师范大学中国科学院大连工业大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金博士科研启动基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- D-氨基酸氧化酶研究进展被引量：5
- 2010年
- D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase:oxidoreductase,DAAO,EC1.4.3.3)是一种以黄素腺嘌呤(FAD)为辅基的典型黄素蛋白酶类,可氧化D-氨基酸的氨基生成相应的酮酸和氨。在体内D-氨基酸的代谢中起着重要作用。主要介绍了D-氨基酸氧化酶的生理功能和应用、表达条件优化及通过定点突变对酶学性质的研究。
- 郭姣洁薛永常徐书景张彩凤何广正鞠建松
- 关键词：D-氨基酸氧化酶生理功能定点突变
- 嗜酸热脂环酸杆菌中甘露聚糖酶活性位点的确立被引量：4
- 2011年
- 【目的】通过定点突变确定嗜酸热脂环酸杆菌中甘露聚糖酶的活性催化位点。【方法】根据序列比对和GH53家族的结构信息选择可能的催化活性位点,利用重叠PCR法构建定点突变体,采用薄层层析(TLC)法和3,5-二硝基水杨酸(DNS)法检测各酶蛋白活性。【结果】通过重叠PCR法成功构建了7个位点的突变体,其中第150和159位的氨基酸突变对活性改变甚少或几乎没有,而第151和231位谷氨酸的羧基基团的改变以及双位点突变体E2Q则导致其对各种底物催化活性的丧失,说明位于β4和β7折叠的C末端的E151和E231的羧基基团作为功能基团参与了催化反应。【结论】E151和E231分别是新型甘露聚糖酶AaManA的酸碱催化位点和亲核催化位点。
- 徐书景张彩凤薛张伟何广正鞠建松赵宝华
- 关键词：甘露聚糖酶定点突变活性位点
- 改进重叠延伸PCR技术构建定点双突变被引量：6
- 2010年
- 目的:DNA片段中快速构建位点不同的定点双突变体。方法:借鉴DNA shuffling技术中DNA小片段延伸扩增获得全长DNA片段的工作原理,与常规基因定点突变技术相结合,改进重叠延伸PCR技术构建定点双突变。结果:对嗜酸热脂肪杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)Tc-12-31的甘露聚糖酶基因AamanA中两个可能的活性位点E151和E231进行双点突变,先后经过无引物和有引物两步PCR,扩增获得全长DNA,测序结果表明得到预期的定点双突变体;酶活性检测和薄层层析结果表明双点突变体丧失了酶的活性。结论:改良的重叠PCR技术,能经济、简便、高效地获得双点定点突变体,在酶的催化机理的阐述、蛋白质结构改造等分子生物学领域中具有较高的应用价值。
- 徐书景张跃灵张妍赵宝华鞠建松马延和
- 关键词：重叠延伸PCR甘露聚糖酶
