国家自然科学基金(30200156)
- 作品数：7 被引量：8H指数：2
- 相关作者：高荣凯王琰王芃赵晓航陈晓穗更多>>
- 相关机构：中国人民解放军海军总医院军事医学科学院中国人民解放军北京军医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 9E10单抗Fab基因的克隆及噬菌体抗体的表达
- 2004年
- 高荣凯黎立王欲晓陈晓穗王琰
- 关键词：单抗基因克隆噬菌体抗体
- 选择感染性噬菌体技术及应用被引量：1
- 2008年
- 选择感染性噬菌体技术是在传统噬菌体表面展示技术的基础上发展而来的一种新方法,通过将噬菌体感染力的恢复与蛋白间的相互作用偶联起来进行筛选,有效提高了筛选效率,简化了操作过程,降低了本底,为后基因组学的研究提供了便利方法,特别是体内法在理论上适合于库-库筛选,更具有应用价值。
- 高荣凯赵晓航王琰
- 关键词：噬菌体表面展示
- 用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体的包装菌株的构建
- 2008年
- 目的利用λ噬菌体Red重组酶系统,构建用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体的包装菌株。方法采用PCR方法,将完整的噬菌体基因Ⅲ和氯霉素抗性基因拼接,使其两端带有与四环素基因同源的36nt序列;利用λ噬菌体Red重组酶系统,将其整合到大肠杆菌XL1-Blue的附加体上,以替换掉四环素基因,经氯霉素抗性筛选及PCR鉴定,获得包装菌株XLe-pⅢ;将基因Ⅲ缺失的噬菌体基因组导入包装菌株,制备缺陷型辅助噬菌体,集落形成试验检测缺陷噬菌体的感染能力。结果所构建的包装菌株XLe-pⅢ经氯霉素抗性筛选及PCR鉴定,证明氯霉素抗性基因已与噬菌体基因Ⅲ一同整合到附加体上,重组菌不能在含有氨苄西林的LB培养基中生长,仍保留四环素抗性;该包装菌株能用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体,制备的缺陷型辅助噬菌体的滴度为3.0×108。结论利用λ噬菌体Red重组酶系统,已成功构建用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体的包装菌株,以其制备的缺陷型辅助噬菌体有望用于常规筛选或SIP体系。
- 高荣凯王芃王琰
- 关键词：Λ噬菌体辅助噬菌体
- 采用Red重组系统构建包装菌株DH-gIII被引量：1
- 2008年
- 选择感染性噬菌体技术是研究蛋白相互作用的良好手段,获得基因III缺陷的辅助噬菌体是构成SIP体系的关键。为制备基因III缺失的辅助噬菌体,利用λRed重组系统将完整的噬菌体基因III和氯霉素抗性基因整合到大肠埃希菌DH5α的染色体上组氨酸操纵元位点构建包装菌株,经氯霉素抗性筛选并用PCR及组氨酸表型鉴定,获得包装菌株DH-gIII;将缺失功能基因III的缺陷型噬菌体基因组转化到包装菌株中培养制备辅助噬菌体,以集落形成试验来检测缺陷型噬菌体的感染能力,结果滴度可达到4.3×108,只具备一次感染力,表明包装菌株构建成功,能用来制备辅助噬菌体,有望用于SIP体系。
- 高荣凯王芃王琰
- 关键词：RED重组系统辅助噬菌体
- 包装菌株XL-pⅢ的构建及缺陷型辅助噬菌体的制备被引量：1
- 2008年
- 目的构建能用来制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体的包装菌株。方法采用重叠延伸PCR方法将完整的噬菌体基因Ⅲ和氯霉素抗性基因体外拼接起来,利用λRed重组系统将其整合到E.coliXL1-Blue染色体上的组氨酸操纵元位点构建包装菌株,用氯霉素抗性进行筛选,并用PCR及组氨酸表型鉴定;用PCR法构建功能基因Ⅲ缺失的噬菌体基因组,将其转化到包装菌株中培养制备辅助噬菌体,以集落形成来测定滴度。结果重组菌株能在氯霉素抗性平板上生长,PCR扩增可得到目的片段,组氨酸表型缺失,说明靶基因定向重组到了细菌染色体的靶位点,将重组包装菌株命名为XL-pⅢ,以其制备的缺陷噬菌体滴度可达到3.7×108,只具备一次感染力。结论成功构建包装菌株,并能制备辅助噬菌体,有望用于选择感染性噬菌体(SIP)体系。
- 高荣凯王芃王琰
- 关键词：噬菌体
- 琥珀突变型辅助病毒VCSM13N1的构建被引量：6
- 2005年
- 目的:构建带有琥珀突变的辅助病毒VCSM13N1,为建立选择感染性噬菌体(SIP)技术平台奠定基础。方法:选择辅助病毒VCSM13蛋白ⅢN1区的Q51作为靶位点,采用重叠延伸PCR方法对其进行定点突变,经酶切及序列分析进行确认;噬斑计数法检测该琥珀突变在允许和非允许菌株中的开、关效应;以HBsAg抗体作为模式体系来确定该突变子作为辅助病毒的可行性,并对其性能进行综合评价。结果:获得了琥珀突变子VCSM13N1,在允许菌株XL1-Blue中其滴度达到2.5×1011,与野生型VCSM13相似(4×1011),而用非许可菌株HB2151进行噬斑计数时,滴度在106水平,降低了数万倍。来源于菌株HB2151的突变病毒感染XL1-Blue计数噬斑,其滴度最高为5×109,降低了50倍;以其在许可菌中制备HBsAg噬菌体抗体,可以得到与野生型相似的结果。结论:琥珀突变子VCSM13N1可以作为辅助病毒,而且在非允许菌株HB2151中有一定的关闭效应。
- 高荣凯王琰
- 关键词：突变辅助病毒
- 用于库-库筛选体系的抗原表达载体的构建被引量：2
- 2006年
- 选择感染性噬菌体(SIP)技术是研究蛋白质相互作用的良好手段,体内SIP技术在理论上适于库-库筛选,而双载体共包装聚合噬菌体方式是一条有效途径.为构建适合库-库筛选的抗原表达载体,选用TG10载体作为基本载体进行改造,首先克隆噬菌体M13基因间隔区的序列插入TG10中得到质粒pTMI,克隆基因Ⅲ的N1N2区序列,并在其3′端加上一段G4T柔性多肽,将NIN2插入到pTMI载体中Lac启动子的下游得到pTMIN,化学合成Ptrc启动子序列替换pTMIN中的Lac启动子及部分功能基因序列,构建成抗原表达载体pTTMIN,化学合成c-myc的十肽表位插入到G4S后进行融合表达,采用ELISA和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测抗原的表达,结果显示抗原得到了融合表达.用抗体呈现载体对pTTMIN性能进行鉴定,结果表明抗原表达载体可以与抗体呈现载体高效的共包装.综合以上结果说明抗原表达载体构建成功,可望用于库-库筛选体系.
- 高荣凯王琰
- 关键词：抗原
