国家自然科学基金(30400375)
- 作品数：18 被引量：40H指数：4
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- 重组耻垢分枝杆菌经鼻粘膜免疫在小鼠体内的分布与表达被引量：2
- 2006年
- 目的:探讨携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠IL-12基因质粒(pZM03)的重组耻垢分枝杆菌经鼻粘膜免疫在小鼠体内的分布与表达。方法:将携带绿色荧光蛋白(GFP)基因质粒(pUV15)的重组耻垢分枝杆菌滴鼻BALB/c小鼠后2周,处死小鼠,观察肺、脾组织中荧光蛋白和耻垢分枝杆菌的分布;将携带GLS和IL-12质粒(pZM03)的重组耻垢分枝杆菌滴鼻免疫BALB/C小鼠3次,第1次免疫后4周,处死小鼠,用免疫组化检测肺、脾组织中GLS表达,用ELISA检测血清IL-12和肺泡灌洗液特异性SIgA的水平。结果:在BALB/c小鼠肺、脾组织中均检测到绿色荧光蛋白和耻垢分枝杆菌的分布,以及GLS的表达,并有血清IL-12水平升高和粘膜特异性SIgA的产生。结论:携带GFP的重组耻垢分枝杆菌可在肺和脾组织分布;携带GLS和IL-12的重组耻垢分枝杆菌经鼻粘膜免疫小鼠后,可引起呼吸道粘膜特异性抗菌免疫,以及GLS和IL-12的体内表达,为新型疫苗的研究奠定了基础。
- 杨春何永林伊正君李俊明李娜朱道银
- 关键词：绿色荧光蛋白IL-12耻垢分枝杆菌
- 人颗粒溶素与小鼠单链IL-12真核共表达质粒的构建及其在RAW264.7细胞中的表达被引量：11
- 2005年
- 目的构建人天然颗粒溶素(Granulysin,GLS)和小鼠单链IL-12基因的真核共表达载体pZM02并在RAW264.7细胞中进行表达。方法将人GLS和小鼠单链IL-12基因同时克隆进多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,得到真核共表达质粒pZM02,以pZM02转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7,通过RT-PCR、免疫细胞化学和ELISA的方法检测目的基因的表达。结果在转染后的RAW264.7细胞中同时检测到了人GLS和小鼠IL-12的表达。结论人GLS能够与小鼠IL-12在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中实现共表达,pZM02的成功构建为进一步研究GLS与IL-12的协同细胞免疫作用机制和免疫治疗作用奠定了基础。
- 伊正君朱道银陈全李俊明曾伟
- 关键词：颗粒溶素IL-12RT-PCR免疫细胞化学
- GLS和IL-12偶联重组耻垢分枝杆菌免疫效果的观察被引量：2
- 2007年
- 目的:研究携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠IL-12基因质粒(pZM03)偶联重组耻垢分枝杆菌(ATCC607)经鼻黏膜免疫小鼠后,小鼠体内的免疫状况。方法:BALB/c小鼠36只,随机分为生理盐水、pZM03、ATCC607、卡介苗(BCG)、重组ATCC607(即携带pZM03的ATCC607)、灭活重组ATCC607组;采用滴鼻法免疫小鼠,BCG组0、14天各1次,其它组0、4、14天各1次,第0天免疫后4周处死小鼠,用ELISA检测血清中IFN-γ、IL-12、IgG2a、lL-4的分泌水平和淋巴细胞PPD诱导的IFN-γ分泌水平以及肺泡灌洗液特异性SIgA的水平,用MTS法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况。结果:重组ATCC607血清中IFN-γ、IL-12水平与BCG组无明显差异但明显高于其他组(P<0.05),IgG2a水平重组ATCC607组高于BCG组和其他组(P<0.05),各组间IL-4水平差异无统计学意义。重组ATCC607、BCG、灭活重组ATCC607及ATCC607组用PPD均可诱导小鼠脾淋巴细胞增殖,各组间差异无显著意义,但与生理盐水和pZM03组间差异有显著意义(P<0.05)。重组ATCC607组PPD诱导淋巴细胞IFN-γ明显高于其它组(P<0.05),与BCG组比较无显著差异。重组ATCC607等含菌组经鼻黏膜免疫可产生黏膜特异性SIgA。结论:重组ATCC607经鼻黏膜免疫小鼠后,机体特异性免疫特别是细胞免疫和黏膜免疫增强,为重组ATCC607治疗结核病的研究奠定了基础。
- 杨春李娜伊正君何永林李俊明朱道银
- 关键词：耻垢分枝杆菌IL-12细胞免疫鼻黏膜免疫
- 人颗粒溶素的生物学活性研究被引量：1
- 2007年
- 目的全面研究 Mr 9000人颗粒溶素(GLS)的生物学活性,为其作为生物治疗剂应用奠定基础。方法将含 Mr9000GLS 编码基因的 pZM03质粒转染肝癌细胞株 SMMC-7721,通过 MTT 实验、流式细胞仪、Hoechst 染色法检测 GLS 的致肿瘤细胞凋亡活性;将 pZM03转染已感染结核分枝杆菌毒力株 H37Rv 的 RAW264.7细胞,96 h 后裂解细胞作细菌培养及菌落计数,检测 GLS 的细胞内直接杀菌活性。结果将 pZM03质粒转染 SMMC-7721细胞后,从多个角度检测到了 GLS 的致肿瘤细胞凋亡活性;转染荷菌的 RAW264.7细胞96 h 后,菌落计数实验证明 GLS 具有一定的细胞内直接杀菌活性。结论 pZM03质粒编码的 Mrg000GLS 具有天然 GLS 的杀瘤活性和一定的细胞内直接杀菌活性。
- 张黎伊正君杨春何永林朱道银
- 关键词：颗粒溶素肿瘤分枝杆菌结核
- 同种异型抗原激活并套式PCR法克隆人颗粒溶素Mr 15000与Mr 9000活性片段被引量：1
- 2005年
- 目的:采用套式PCR克隆经同种异型抗原激活后的人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表达的颗粒溶素(Granulysin, GLS)Mr 15000与Mr 9000活性片段的编码序列并进行序列测定与分析,为进一步表达纯化该活性片段和研究GLS的免疫杀伤机制奠定基础。办法:抽提经过培养并激活的健康人CTL淋巴细胞总RNA,经逆转录后以套式PCR方法扩增出GLS的Mr 15000 与Mr 9000活性片段的编码序列,插入pET32a(+)载体,转化大肠杆菌TOP10,阳性克隆经PCR及酶切鉴定后进行测序分析。结果:成功扩增出了包含GLSMr 15000与Mr9000活性片段完整编码序列的cDNA,与预期大小相同,PCR、酶切及测序鉴定证明得到了读码框正确的pET32a-Mr 15000与pET32a-Mr 9000重组子。序列分析表明GLS基因编码产物在第119 位存在氨基酸多态性。结论:人天然颗粒溶素Mr 15000与Mr 9000活性片段编码序列能够通过以上方法获得和克隆并用于后续研究。
- 伊正君朱道银杨春何永林刘晔华
- 关键词：颗粒溶素细胞毒性T淋巴细胞套式PCR
- GLS/IL-12重组耻垢分枝杆菌的构建及其在小鼠体内的表达被引量：4
- 2007年
- 目的构建携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠IL-12基因质粒(pZM03)的重组耻垢分枝杆菌,并经鼻黏膜免疫观察其在小鼠体内的表达。方法将人GLS和小鼠IL-12基因及分枝杆菌复制子OriM同时克隆进多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,得到穿梭质粒pZM03,以pZM03电转化耻垢分枝杆菌,再将该重组耻垢分枝杆菌滴鼻免疫Balb/c小鼠3次,第1次免疫后4周,处死小鼠,用免疫组化检测肺、脾组织中GLS表达,用ELISA检测血清IL-12和肺泡灌洗液特异性SIgA的水平。结果得到可表达GLS/IL-12重组耻垢分枝杆菌;在Balb/c小鼠肺、脾组织中均检测到重组耻垢分枝杆菌的分布,以及GLS的表达,并有血清IL-12水平升高和黏膜特异性SIgA的产生。结论成功构建GLS和IL-12修饰的重组耻垢分枝杆菌,该重组菌经鼻黏膜免疫小鼠后,可引起呼吸道黏膜特异性抗菌免疫,以及GLS和IL-12的体内表达,为新型疫苗的研究奠定了基础。
- 杨春何永林伊正君李俊明李娜朱道银
- 关键词：IL-12耻垢分枝杆菌鼻黏膜免疫
- 颗粒溶素活性肽与增强型绿色荧光蛋白融合基因真核表达质粒的构建及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达被引量：2
- 2008年
- 目的构建人颗粒溶素(GLS)活性肽(9ku-GLS)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因的真核表达载体,并检测其在小鼠黑色素瘤细胞B16中的表达。方法经PCR扩增9ku-GLS基因,插入质粒pBudCE4.1中,经酶切及测序鉴定正确后,亚克隆至质粒pEGFP-C1中,将融合基因真核表达质粒pEGFP-C1/S9K转染B16细胞,采用荧光显微镜及RT-PCR法检测融合蛋白的表达。结果融合基因真核表达质粒pEGFP-C1/S9K经双酶切鉴定证明构建正确,转染B16细胞24h后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,且经RT-PCR可扩增出267bp的目的基因片段。结论已成功构建9ku-GLS与EGFP融合基因的真核表达质粒,且在B16细胞中表达了融合蛋白。
- 何永林朱道银伊正君杨春徐蕾王瑜伟
- 关键词：颗粒溶素增强型绿色荧光蛋白融合基因真核表达黑色素瘤细胞
- 人颗粒溶素在小鼠巨噬细胞中的表达及其致细胞损伤与诱导凋亡的作用
- 2006年
- 目的构建编码活化的人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表达的天然颗粒溶素(granulysin,GLS)基因的真核表达载体pBudCE4.1/GLS,并转染不同种系来源的小鼠腹腔巨噬细胞。观察GLS在其中的表达及其可能的致细胞损伤与诱导凋亡的作用。方法将人GLS的编码序列从pEGFP-C1/GLS质粒亚克隆入pBudCE4.1真核表达载体中,鉴定正确后转染不同种系来源的小鼠腹腔巨噬细胞。采用RT-PCR及免疫细胞化学染色法检测GLS的表达。通过测定转染细胞培养上清中的乳酸脱氢酶反映细胞的损伤;通过胞核DNA荧光染色法检测细胞的凋亡。结果成功地构建了读码框正确的pBudCE4.1/GLS重组子,并在靶细胞中得到高效表达。表达后48h,观察表达产物对宿主细胞未见有明显的致细胞损伤和诱导凋亡的作用。结论人GLS基因能够在小鼠巨噬细胞中有效表达。该表达产物对小鼠巨噬细胞无明显的致细胞损伤与诱导凋亡的作用,为进一步建立研究GLS免疫学活性的动物模型奠定了基础。
- 伊正君朱道银李俊明杨健何永林曾伟李娜
- 关键词：细胞毒性T淋巴细胞颗粒溶素免疫细胞化学染色凋亡
- 9ku颗粒溶素活性肽重组减毒沙门菌的构建与表达被引量：2
- 2007年
- 目的构建人9ku颗粒溶素(granulysin)的重组减毒沙门菌,并在真核细胞中表达,为下一步利用颗粒溶素基因治疗肿瘤奠定基础。方法以含有颗粒溶素cDNA序列的质粒为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得含分泌肽编码基因的9ku的颗粒溶素基因片段后,定向插入真核表达载体pBudCE4.1中,获得重组表达质粒pBudCE4.1-S9K,通过PCR、双酶切及插入片段序列测定对重组质粒进行鉴定;采用RT-PCR,免疫细胞化学与Dot-ELISA法检测pBudCE4.1-S9K在RAW264.7细胞的瞬时表达与分泌;重组质粒电转化减毒沙门菌后,将重组菌感染巨噬细胞,以RT-PCR检查颗粒溶素的表达。结果成功扩增出含分泌肽编码基因的9ku的颗粒溶素基因片段;经酶切,PCR及测序鉴定证明得到读码框正确的重组质粒;转染细胞证实可分泌表达9ku颗粒溶素;重组减毒沙门菌感染细胞后,检测到颗粒溶素的表达。结论成功构建含9ku颗粒溶素活性肽基因的重组减毒沙门菌,该菌能成功递呈携带基因在感染细胞内表达。
- 何永林张黎朱道银伊正君杨春徐蕾
- 关键词：颗粒溶素真核表达质粒
- 重组耻垢分枝杆菌联合抗痨药物对鼠结核病治疗作用的探讨
- 2009年
- 目的:探讨携带编码人天然颗粒溶素(Granulysin,GLS)和小鼠IL-12基因的重组耻垢分枝杆菌(M.smegmatis,MS)与抗痨药物对结核分枝杆菌感染的协同治疗效果。方法:将结核分枝杆菌H37Rv感染的Balb/c小鼠40只随机分成4组。感染4周后分别用生理盐水、重组MS、INH+PZA和重组MS联合INH+PZA治疗,于第一次治疗后3个月,处死小鼠,检测器官荷菌量、脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平、血清IL-12和IFN-γ和肺、脾组织中GLS表达,同时观察小鼠肺、脾组织病理改变情况。结果:重组MS联合INH+PZA治疗组肺、脾组织荷菌量(lgCFU/g)比重组MS和INH+PZA治疗组显著降低;重组MS和INH+PZA治疗组肺、脾组织荷菌量比生理盐水组显著降低。重组MS组经PPD刺激后IFN-γ和TNF-α分泌水平明显高于其它组。重组MS联合INH+PZA治疗组和重组MS组血清IL-12和IFN-γ水平明显高于生理盐水组。重组MS和INH+PZA组病变轻且局限,生理盐水组肺组织病理改变以渗出为主,病变广泛。重组MS联合INH+PZA治疗组肺组织病变最轻。结论:GLS/IL-12重组MS对小鼠结核病有一定免疫治疗作用;重组MS联合临床常用的抗痨药可增强抗结核病的疗效。
- 杨晓燕杨春何永林徐蕾
- 关键词：颗粒溶素IL-12结核病抗痨药
