国家自然科学基金(30200122)
- 作品数：6 被引量：13H指数：2
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- 高效表达人端粒酶RNA逆转录病毒的构建及其对肝细胞增殖的影响
- 2006年
- 背景:基因修饰供体肝细胞以提高其增殖能力是改善肝细胞移植疗效的关键,人端粒酶RNA(hTR)基因是上调端粒酶活性、促进肝细胞增殖的一个重要因素,与肝细胞增殖密切相关。目的:构建新型高效表达hTR的逆转录病毒,体外感染原代培养肝细胞,观察对大鼠肝细胞增殖的影响。方法:将hTRcDNA片段与能促进RNA表达的启动子H1连接后,插入逆转录病毒载体pLXSN基因组中,获得重组逆转录病毒载体pLXSN-H1-hTR,DH5α细菌内扩增后,与辅助包装质粒pCL-Ampho共转染包装细胞293-T后获得可表达hTR的逆转录病毒,测定滴度,感染原代培养肝细胞,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测hTR在肝细胞中的表达,四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法观察hTR过表达对细胞增殖影响。结果:经抗生素筛选和限制性核酸内切酶酶切、测序鉴定,最终获得滴度为2×106菌落形成单位(cfu)/ml高效表达hTR的重组逆转录病毒——Re-H1-hTR;Re-H1-hTR感染组hTR表达最为明显;病毒Re-H1-hTR感染的肝细胞株Super-YL和Re-hTR感染的肝细胞株YL增殖能力均较对照组明显增强,其中肝细胞株Super-YL增殖水平较YL上调更为明显(P<0.05)。结论:利用新型表达hTR的重组逆转录病毒可将外源hTR基因导入肝细胞中,并维持高效表达,可显著提高肝细胞增殖能力,为基因修饰移植肝细胞提供新的手段。
- 岳海燕曾欣林勇陈伟忠谢渭芬张新陈岳祥杨秀疆
- 关键词：人端粒酶RNA逆转录病毒科肝细胞细胞移植逆转录聚合酶链反应
- 肝细胞核因子与肝细胞分化基因调控被引量：4
- 2006年
- 尹川曾欣林勇谢渭芬
- 关键词：肝细胞核因子细胞分化调控基因调控增强子结合蛋白CCAAT
- 导入外源人尿激酶型纤溶酶原激活剂基因对肝星状细胞胶原沉积的影响被引量：6
- 2004年
- 目的 利用重组复制缺陷型腺病毒载体将外源非分泌型人尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)基因导入活化的肝星状细胞 (HSC)内 ,研究uPA表达对HSC胶原沉积的影响。方法 细菌内同源重组构建表达非分泌型uPA的复制缺陷型重组腺病毒AduPA。体外感染肝星状细胞株HSC T6 ,Northern印迹法和免疫细胞化学法检测uPA在HSC中的表达。酶联免疫吸附实验测定培养上清基质金属蛋白酶 2 (MMP 2 )分泌水平。免疫细胞荧光法测定外源uPA基因导入对HSC胞质内Ⅰ、Ⅲ型胶原含量变化的影响。结果 同源重组最终获得约 5× 1 0 1 1 efu/mlAduPA。AduPA体外感染HSC 3d后 ,Northern印迹法和免疫细胞化学法显示uPAmRNA及蛋白表达明显增加 ,细胞上清液中MMP 2分泌水平达 (2 74 .4 5± 7.6 3) pg/ml,明显高于对照组的 (1 4 5 .85± 6 .5 8)pg/ml(P <0 .0 1 )。免疫细胞荧光法提示uPA基因导入HSC后 ,胞质内Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显减少。结论 通过重组腺病毒载体将外源uPA基因导入HSC内可维持uPA高效表达并上调MMP 2分泌水平 ,减少细胞外基质沉积 。
- 林勇陈伟忠谢渭芬曾欣张新陈岳祥张忠兵杨秀疆
- 关键词：纤溶酶原激活剂基因胶原沉积肝纤维化
- 小干扰RNA治疗肝病研究进展被引量：1
- 2006年
- RNA 干扰（RNA interference,RNAi）是一种新兴的序列特异性基因治疗策略,它利用21-24 bp小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）片段诱导序列互补mRNA降解,导致目的基因转录后活性下调,从而调控生物体内功能基因表达.目前该技术已广泛应用于基因治疗研究,有望为疾病治疗提供新的手段.近年来,siRNA治疗急慢性肝病研究取得了很大的进展,现就此作一综述.
- 许晶曾欣林勇谢渭芬
- 关键词：小干扰RNA肝病研究特异性基因SIRNA基因转录
- 导入外源肝细胞生长因子基因对肝细胞增殖的影响被引量：1
- 2003年
- 目的 利用重组腺病毒载体将外源人肝细胞生长因子(HGF)基因导入原代培养的大鼠肝细胞, 观察HGF表达对肝细胞增殖特性的影响。方法 同源重组构建表达HGF的复制缺陷型重组腺病毒AdHGF,用 其感染原代培养的肝细胞。逆转录聚合酶链反应检测肝细胞HGF和c—met(HGF受体)mRNA的表达;酶联免 疫吸附实验测定培养上清液中HGF水平。MTS测定感染前后细胞增殖情况;流式细胞仪测定细胞周期的变化; 细胞免疫荧光法检测HGF基因导入后增殖细胞核抗原(PCNA)表达。结果 同源重组获得约4×10^(10)efu/ml 滴度的AdHGF。AdHGF感染原代培养肝细胞后,肝细胞HGF和c-met mRNA表达均明显上调;细胞上清液 中HGF分泌水平显著增加,达到(5 939.00±414.39)pg/ml(F=13.661,P<0.01)。细胞增殖能力增强(F ≥15.158,P<0.01),细胞周期由G_0/G_1期向S期转化(X^2=41.616,P<0.01);细胞免疫荧光法提示HGF 基因导入后PCNA指数显著提高(F=42.122,P<0.01)。结论 通过重组腺病毒载体将外源HGF基因 导入肝细胞后可维持HGF高效表达并能促进肝细胞增殖,是基因修饰供体肝细胞、增强肝细胞移植治疗效 果的有效方法。
- 林勇谢渭芬陈伟忠张新曾欣陈岳祥杨秀疆张忠兵
- 关键词：基因肝细胞增殖肝移植
- 微小RNA与消化系统疾病诊治研究被引量：1
- 2006年
- 微小RNA（miRNA）是生物体内源产生的小RNA分子，它介导序列互补mRNA断裂或阻抑其翻译合成蛋白质，调控目的基因表达。越来越多的研究表明，miRNA是重要的转录后基因调控元件，其表达直接影响相关编码蛋白基因功能，参与包括消化系统在内的多个系统生理和病理生理过程。miRNA有望成为消化系统疾病基因诊断和治疗的新手段，本文就此作一综述。
- 许晶曾欣林勇谢渭芬
- 关键词：消化系统疾病RNA分子病理生理过程调控元件合成蛋白质
