北京市科技计划项目(H030230250130)
- 作品数：3 被引量：12H指数：2
- 相关作者：李连华杨新宇翁习生邱贵兴吴志宏更多>>
- 相关机构：北京协和医院北京军区总医院中国疾病预防控制中心更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- 增强绿色荧光蛋白标记比较腺病毒、腺相关病毒体外转染兔软骨细胞的效果被引量：3
- 2008年
- 目的通过增强绿色荧光蛋白（eGFP）标记，比较腺病毒（Ad）、腺相关病毒（AAV）对体外培养软骨细胞的转染效果。方法体外培养正常3月龄新西兰兔关节软骨细胞，以rAd5-eGFP、rAAV2-eGFP分别转染原代关节软骨细胞，计算最佳传染复数。之后以最佳传染复数的病毒重组体转染软骨细胞，分别应用流式细胞仪检测绘制转染率的时间-反应曲线，倒置荧光显微镜下观察转染后细胞的大体形态、绿色荧光的表达情况并应用荧光定量PCR检测转染前后软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达水平的变化。结果rAd5-eGFP、rAAV2-eGFP的最佳传染复数分别为1×10^3vp／cell和1×10^5vg／cell。分别应用最佳传染复数体外转染原代培养的软骨细胞后，rAd5-eGFP在转染后1～2d荧光表达即可达到高峰，但之后迅速衰减，在转染后第28天基本检测不到荧光表达。rAAV2-eGFP在转染第7天荧光表达达高峰，随之缓慢衰减，在转染后第56天仍可检测到绿色荧光表达。荧光定量PCR检测显示，rAd5-eGFP在转染软骨细胞后，软骨细胞合成Ⅱ型胶原mRNA的水平明显下降，而rAAV2-eGFP则影响不显著。结论Ad转染体外培养的关节软骨细胞后，目的基因的表达迅速，但维持时间短，对软骨细胞表型的影响较明显；AAV转染软骨细胞后，目的基因的表达缓慢，但维持时间长，且对软骨细胞表型的影响较小。AAV更适于作为软骨细胞的体外转染载体。
- 翁习生李连华邱贵兴杨新宇吴小兵
- 关键词：软骨细胞腺病毒科转染
- 2型重组腺相关病毒转染新西兰兔关节软骨细胞的体外研究被引量：9
- 2006年
- 目的为进一步研究腺相关病毒重组体在体内间接和直接基因治疗的效果提供依据。方法应用AAVMaxTM包装系统,复制和包装2型腺相关病毒重组体,进行纯化和滴度检测后,按照不同的转染指数(MOI)转染体外培养的新西兰兔关节软骨细胞,观察转染效果与及转染效果与时间的关系。倒置荧光显微镜观察证实表转染成功,流式细胞仪检测转染效果,包括表达绿色荧光信号细胞的百分比和平均荧光强度,将未转染的软骨细胞自发表达的绿色荧光信号百分比的最大值4·76%和荧光信号强度的最大值1·04设定为空白对照。结果当MOI值在1×105v·g·/cell以下时,MOI值(v·g·/cell)与转染率之间的剂量-反应曲线为正相关的线性关系,在MOI超过105v·g·/cell时,转染率不会再有显著的提高。在转染第7天,绿色荧光信号表达达到了峰值,随着转染时间的延长和传代次数的增加,表达绿色荧光信号的软骨细胞百分比和荧光强度均呈现降低趋势,但在转染后第56天仍可检测到绿色荧光蛋白的表达。结论2型腺相关病毒重组体在体外对新西兰兔关节软骨的转染效果良好;增强绿色荧光蛋白是观察2型腺相关病毒重组体转染关节软骨细胞效果一种良好的报告基因。
- 李连华翁习生邱贵兴吴志宏林进金今王炜杨新宇
- 关键词：基因疗法荧光抗体技术软骨细胞转染
- 增强绿色荧光蛋白标记腺病毒、腺相关病毒体内转染新西兰兔软骨细胞效果比较
- 2011年
- 目的通过绿色荧光蛋白标记,比较腺病毒、腺相关病毒对新西兰兔膝关节软骨的转染效果。方法制作含增强绿色荧光蛋白(eGFP)基因的5型腺病毒重组体(rAd5)和2型腺相关病毒重组体(rAAV2)。分别在正常新西兰兔和骨关节炎动物模型的新西兰兔膝关节腔内注射rAd5和rAAV2,分别在转染后1、3、5周处死,肉眼观察关节腔内软骨及关节滑液改变,抽取关节液测量关节液中白细胞数目,计算关节软骨中软骨细胞的转染率和转染强度,抽取动物静脉血,培养293细胞,流式细胞仪检测eGFP表达情况。结果 rAAV2转染组1周后非骨关节炎模型转染率为(6.3±1.7)%,转染强度为1.6±0.6,骨关节炎模型转染率为(19.8±2.1)%,转染强度为5.2±1.3。3周后非骨关节炎模型转染率为(7.9±0.8)%,转染强度为1.9±0.4,骨关节炎模型转染率为(18.1±1.5)%,转染强度为4.2±1.1。5周后非骨关节炎模型转染率为(5.4±0.7)%,转染强度为1.5±0.4,骨关节炎模型转染率为(14.0±2.2)%,转染强度为3.6±1.2。rAd5转染组3d后非骨关节炎模型转染率为(3.6±1.5)%,转染强度为1.6±1.0,骨关节炎模型转染率为(17.2±2.3)%,转染强度为9.3±1.8。1周后非骨关节炎模型转染率为(1.2±0.4)%,转染强度为0.3±0.1,骨关节炎模型转染率为(7.5±2.3)%,转染强度为1.8±0.5。3周后非骨关节炎模型转染率为(0.5±0.3)%,转染强度为0.2±0.1,骨关节炎模型转染率为(1.0±0.5)%,转染强度为0.2±0.1。在转染高峰期,无论是非骨关节炎模型,还是骨关节炎动物模型,rAAV2转染的转染强度和转染率均要显著优于rAd5转染(P<0.01)。rAd5转染后关节腔内白细胞数目较rAAV2转染明显增高(P<0.01)。在各组血液中均未见病毒重组体表达。结论两种病毒重组体应用体内转染方法均可在关节腔内得到良好的转染效果,但rAd5组早期高度表达,效果维持差,对关节腔内毒性作用较大,而rAAV2组转染效果比较温和,维持效果较好,毒性�
- 李连华翁习生杨新宇吴志宏翟吉良
- 关键词：软骨细胞腺病毒科转染
