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p27Kip1基因shRNA表达质粒的构建鉴定及功能研究被引量：4: 2007年; 目的构建细胞周期性激酶抑制剂p27Kip1的小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,并观察其对牛角膜内皮细胞增殖能力的影响。方法设计有发夹状结构的3条p27Kip1-shRNA对应模板DNA序列,并构建无关序列HK-shRNA作为阴性对照。转入带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和启动子U6的pGenSil-1质粒,构建重组质粒pGenSil-1/p27Kip1-1、pGenSil-1/p27Kip1-2、pGenSil-1/p27Kip1-3、pGenSil-1/HK。转化DH5α菌株,提取质粒行酶切及测序鉴定。以脂质体法将4个重组质粒分别导入牛角膜内皮细胞。转染后48h以Western blot法检测p27Kip1蛋白水平及MTT法检测各实验组和对照组细胞增殖情况。结果酶切及测序证实4个重组质粒均构建成功。3个实验组p27Kip1蛋白水平分别下降了66.41%、61.51%、71.32%,shRNA可显著促进牛角膜内皮细胞增殖。结论成功构建了针对p27Kip1的RNA干扰表达载体。; 黄渝侃张明昌王勇张进祥范可顺张光红; 关键词：RNA干扰 P27KIP1 质粒

针对p27Kip1基因的小发夹RNA对牛角膜内皮细胞增殖的影响被引量：3: 2009年; 目的探讨针对p27Kip1基因的小发夹RNA（shRNA）表达质粒对牛角膜内皮细胞（bCEC）增殖能力的影响。方法实验研究。设计有发夹状结构的3条p27Kip1—shRNA对应模板DNA序列，并构建无关序列HK—shRNA作为阴性对照。构建并鉴定重组质粒Pgenesil-P1、Pgenesil-P2、Pgenesil—P3及Pgenesil-HK。以脂质体法将以上4种质粒分别转染bCEC，并设立空白组。稳定转染后采用RT-PCR和Westem免疫印迹法检测bcEc内p27Kip1的mRNA及其蛋白水平，筛选出抑制效果最好的阳性siRNA质粒。用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测该质粒组、Pgenesil-HK组及空白组的细胞生长情况。流式细胞术检测各组细胞周期的分布。以上数据结果均采用单因素方差分析。结果酶切及测序证实4个重组质粒均构建成功。与空白组比较，Pgenesil-P1、Pgenesil—P2、Pgenesil—P3各组mRNA的抑制效率分别为32．71％、67．76％及80．28％（F=453．102，P=0．000），蛋白表达水平降低为29．27％、64．73％及76．13％（F=75．385，P=0．000），以Pgenesil—P3抑制效果最明显。空白组与Pgenesil—HK组比较蛋白水平（P=0．356）和mRNA水平（P=0．246）均差异无统计学意义。与空白对照和阴性siRNA相比，Pgenesil—P3组bCEC增殖能力提高，G1期细胞比例下降（F=134．224，P=0．000），S期比例增加（F=334．957，P=0．000）。结论针对p27Kip1的shRNA可有效降低p27Kip1基因及其蛋白的表达水平，并可提高bCEC增殖能力。RNA干扰介导的p27Kip1基因沉默可能是促进角膜内皮细胞再生的有效手段。; 黄渝侃张明昌王勇范可顺姜冬玲张光红周龚莉; 关键词：小分子干扰周期素依赖激酶抑制剂P27 内皮细胞增殖

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湖北省自然科学基金(2004ABA250)

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