国家自然科学基金(30570641)
- 作品数：6 被引量：4H指数：1
- 相关作者：李柱一徐江陈辉张惠中孙辰婧更多>>
- 相关机构：第四军医大学唐都医院第四军医大学北京军区总医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 大鼠补体调节因子DAF功能区的表达纯化及功能鉴定
- 2006年
- 目的:重组表达促衰变因子(DAF)功能区的4个短的保守重复序列(SCR1-4)。方法:通过克隆大鼠DAF的SCR1-4并插入到原核表达载体pET32a(+),IPTG诱导共表达,根据表达结果选择纯化方式。结果:诱导后表达产物为不溶蛋白,通过纯化包涵体并复性,得到了具有抑制致敏绵羊红细胞发生溶血的可溶性蛋白成分。结论:原核表达SCR1-4易于形成包涵体,稀释复性法适用于DAFSCR1-4包涵体的复性。
- 徐江张惠中林芳刘丽王燕任继鸿李柱一
- 关键词：DAF包涵体蛋白复性
- 重组表达人乙酰胆碱受体α1亚基胞外域蛋白被引量：2
- 2009年
- 目的获得大量正确折叠的重组人乙酰胆碱受体(AChR)α1亚基N末端胞外域(ECD)蛋白。方法用RT-PCR方法从TE671细胞中扩增出AChRα1亚基全序列,在此基础上再扩增出ECD基因序列并将其插入到原核表达载体pET16b。以构建的新载体转化E.coliBL21(DE3)pLysS,培养物以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并通过SDS-PAGE比较诱导前后蛋白表达情况。重组蛋白以Ni2+亲和层析纯化。蛋白透析复性后,以ELISA法检测活性。结果PCR产物大小为650 bp,与预计相符;所构建质粒经测序证实ECD核苷酸序列正确,并正确插入载体pET16b。诱导所产生的大量包涵体蛋白经复性后正确折叠且具活性。结论可通过原核表达获得大量正确折叠的可溶性重组人肌肉AChRα1亚基ECD蛋白。
- 孙辰婧徐江李柱一
- 关键词：重症肌无力乙酰胆碱受体
- 抗乙酰胆碱受体单链抗体基因克隆与表达
- 2012年
- 目的重建含有抗乙酰胆碱受体(AChR)单链抗体1929#(single-chain Fv antibody 1929#,scFv1929#)基因的载体并在大肠杆菌(E.coli)进行表达,提高scFv1929#的可溶性表达量。方法用聚合酶链反应法(PCR)扩增载体pHEN1中的scFv1929#结构基因,将扩增产物定向克隆至载体pET32a(+)的多克隆位点中构建新的载体pET32a(+)-scFv1929#,经EcoR v和NotⅠ双酶切后进行鉴定,并将所构建载体转化入表达宿主E.coli BL21(DE3)plysS菌株内诱导表达后集菌并裂菌,将诱导前菌体、诱导后菌体,以及裂菌后所得诱导后上清、诱导后沉淀进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,并采用Western blot(WB)法进行鉴定。结果鉴定结果显示载体pET32a(+)-scFv1929#中所插入的scFv1929#基因片段大小为730bp,与预计相符,经测序确定该基因序列无误。SDS-PAGE电泳结果显示37℃下诱导前菌体、诱导后菌体、诱导后上清、诱导后沉淀中均可在相对分子质量(Mr)接近44 000处见到蛋白条带,其中诱导后菌体及诱导后沉淀中的条带较粗大。经WB法证实融合蛋白scFv1929#具有较高特异性。结论 scFv1929#表达载体pET32a(+)-scFv1929#被成功构建,并可在大肠杆菌中高效表达,其表达产物具有较好特异性。
- 陈辉李柱一徐江
- 关键词：单链抗体克隆
- 实验性自身免疫性脑脊髓炎对大脑神经干细胞增殖的影响被引量：1
- 2010年
- 目的探讨实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)埘大脑神经干细胞(NSC)增殖能力的影响。方法将C57BL/6小鼠随机分为模型组、佐剂组和对照组,采用少突胶质细胞糖蛋白(MOG)抗原联合完全福氏佐剂(CFA)免疫模型组小鼠,佐剂组小鼠仅接受CFA免疫注射,对照组小鼠仅接受生理盐水注射。观察各组小鼠EAE症状评分,采用HE染色以及劳克坚牢蓝(LFB)髓鞘染色观察其脑和脊髓病理学改变,采用免疫荧光染色检测小鼠海马齿状回(DG)和侧脑室下区(SVZ)BrdU阳性细胞数量,以评价NSC增殖情况。结果模型组有14只(14/15)小鼠被成功诱导EAE,其症状达到高峰后短暂缓解,随后进入慢性持续期;而佐剂组和对照组小鼠均未出现任何EAE症状。模型组中枢神经系统存在大量炎性反应细胞浸润,在白质区可见多处LFB未着色的髓鞘脱失区;而佐剂组和对照组无明显病理学改变。佐剂组与对照组小鼠DG区和SVZ区BrdU阳性细胞数比较差异均无统计学意义。与佐剂组和对照组比较,模型组小鼠大脑SVZ区和DG颗粒下区BrdU阳性细胞均显著降低(均P<0.05)。结论慢性持续型EAE可导致小鼠大脑NSC增殖能力下降。
- 郭俊李宏增林宏苗建亭宿长军李柱一
- 关键词：脑脊髓炎实验性自身免疫性神经干细胞增殖
- 抗乙酰胆碱受体单链抗体原核表达载体及表达菌株的构建
- 2006年
- 目的将含有抗人乙酰胆碱受体(AChR)单链抗体基因的载体重新构建并建立表达菌株。方法采用聚合酶链反应(PCR)从质粒pHEN1中克隆单链抗体scFv1929#全长基因,将PCR产物再定向克隆至载体pET32a(+)的多克隆位点中,并转入大肠杆菌BL21(D E3)plysS以构建表达菌株。结果PCR产物约730bp,与预期一致,重组阳性克隆菌株JM109+pET32a(+)-scFv1929#经菌液PCR可见730 bp处有特异性条带,所提取质粒pET32a(+)-scFv1929#经PCR及酶切鉴定正确,经测序后证实scFv1929#的核苷酸序列正确并正确地插入载体pET32a(+)的读码框内。将新构建载体转化大肠杆菌BL21(D E3)plysS以获得表达菌株。结论已成功地重新构建含有抗AChR单链抗体基因的载体并建立大肠杆菌表达菌株BL21(D E3)plysS+pET32a(+)-scFv1929#,为今后表达抗AChR单链抗体scFv1929#融合蛋白打下基础。
- 陈辉李柱一徐江张惠中
- 关键词：单链抗体乙酰胆碱受体原核表达载体
- 抗人乙酰胆碱受体单链抗体1956#在大肠杆菌中的可溶性表达被引量：1
- 2008年
- 目的:重组表达抗人乙酰胆碱受体(AChR)单链抗体(scFv)1956#,提高scFv1956#的可溶性表达量。方法:用PCR扩增含抗人AChR scFv1956#的载体pHEN1中的scFv1956#结构基因,并将其插入到原核表达载体pET44a(+)。用重新构建的载体转化E.coli BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达。用SDS-PAGE来比较更换载体及不同温度和时间对可溶性表达量的影响,并通过Western blot进行鉴定。结果:PCR产物大小为785bp,与预计相符;所构建质粒经测序证实scFv1956#核苷酸序列正确,并正确插入载体pET44a(+)。诱导后得到的可溶性表达量优于原载体pHEN1。结论:载体pET44a(+)表达的端融蛋白NusA可以帮助scFv1956#的正确折叠,从而获得大量可溶性表达。低温长时间诱导有助于提高可溶性表达的量。
- 宋琛徐江张芳琳白文涛李柱一
- 关键词：重症肌无力乙酰胆碱受体单链抗体NUSA
