国家教育部博士点基金(20111106110024)
- 作品数：4 被引量：0H指数：0
- 相关作者：张业沈珝琲杨光辉蔡昀阎海霞更多>>
- 相关机构：中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院中国医学科学院北京协和医学院更多>>
- 发文基金：国家教育部博士点基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 精氨酸甲基转移酶CARM1 shRNA慢病毒表达质粒的构建及稳定敲低CARM1的小鼠畸胎瘤P19细胞系的建立
- 2014年
- 目的构建慢病毒表达小鼠CARM1基因shRNA的质粒,观察其在小鼠畸胎瘤P19细胞中对CARM1的表达抑制效率。验证CARM1 shRNA慢病毒表达质粒,进一步筛选得到稳定敲低CARM1的小鼠畸胎瘤P19细胞系。方法设计并且合成针对小鼠CARM1 mRNA不同部位的4组shRNA序列,以AgeⅠ和EcoRⅠ克隆入pLKO.1慢病毒载体中,得到含shRNA的慢病毒表达质粒。氨苄青霉素筛选后,DNA测序鉴定结果。鉴定正确的质粒大量制备后,与慢病毒包装辅助质粒psPAX2、pMD2.G共同转染HEK293T细胞,包装得到具有感染能力的慢病毒。将含病毒的培养基上清感染P19细胞后,经嘌呤霉素筛选获得CARM1稳定敲低的P19细胞系,并用Western blot法和实时荧光定量PCR进行鉴定。结果测序鉴定表明4组CARM1 shRNA慢病毒表达质粒构建成功。Western blot法检测和实时荧光定量PCR分析结果显示4组CARM1 shRNA慢病毒表达载体中的2组可有效地抑制小鼠畸胎瘤P19细胞中CARM1基因的表达,即pLKO.1/CARM1 shRNA2、pLKO.1/CARM1 shRNA3有明显的抑制效果。结论成功构建了针对CARM1基因的shRNA的慢病毒表达质粒并筛选得到稳定敲低CARM1表达的P19细胞系,为进一步研究CARM1基因的功能奠定了基础。
- 冯炯杨光辉沈珝琲张业
- 关键词：SHRNA慢病毒
- JMJD6参与调节肿瘤抑制因子p53的转录活性
- 2012年
- 目的确定JMJD6与转录因子p53的相互作用,研究JMJD6对p53转录活性的影响,并通过鉴定JMJD6的赖氨酸羟化酶活性探讨其可能的作用机制。方法免疫共沉淀技术和GST pull-down实验分析JMJD6和p53的相互作用及其作用区域;荧光素酶双报告基因系统检测JMJD6对p53靶基因启动子活性的影响;体外羟基化实验和质谱鉴定JMJD6的羟化酶活性。结果 JMJD6与p53相互作用,并由p53的C端结构域介导;JMJD6参与激活p53的转录活性;JMJD6具有赖氨酸羟化酶活性,可以催化组蛋白H4发生羟基化。结论赖氨酸羟化酶JMJD6可以结合肿瘤抑制因子p53并参与调节其转录活性。
- 张艳君程谟斌代辉沈珝琲张业
- 关键词：P53
- 利用CRISPR-Cas9系统建立Prmt1敲除的小鼠胚胎干细胞系
- 2015年
- 目的利用CRISPR-Cas9系统构建Prmt1敲除的E14小鼠胚胎干细胞系,并分析验证其敲除效果。方法利用第3代基因编辑技术CRISPR-Cas9系统,针对Prmt1第4、5、6、7外显子设计4条gRNAs,gRNA两两组合转染E14细胞,特异性的敲除E14细胞中的Prmt1,并在蛋白质水平,mRNA水平和基因组水平分别验证敲除效果。结果与对照组相比,两组敲除实验组都检测不到Prmt1蛋白质和mRNA的表达,基因组测序结果分析显示,两实验组中Prmt1的mRNA均出现无义突变,使其mRNA的翻译异常终止。同时,实时定量PCR结果显示,精氨酸甲基转移酶家族其他成员Prmt2,Carm1和Prmt6 mRNA表达不受影响。结论成功获得特异性敲除Prmt1的E14细胞系,为研究Prmt1在胚胎干细胞中的作用提供了重要工具。
- 蔡昀杨光辉张业
- 关键词：小鼠胚胎干细胞
- 近红外双荧光系统在磷酸酯酶筛选中的应用
- 2014年
- 目的应用奥德赛(Odyssey)近红外双荧光系统筛选去甲基化酶KDM3A去磷酸化的磷酸酯酶。方法使用磷酸酯酶干扰质粒转染HEK293T细胞,使用磷酸化的KDM3A抗体对细胞进行杂交,近红外荧光染料DRAQ5标记细胞核,利用奥德赛(Odyssey)近红外双荧光系统对细胞进行荧光扫描,荧光强度的比值可代表细胞内相对KDM3A磷酸化水平,进而筛选出相关的磷酸酯酶。结果磷酸酯酶广谱抑制剂冈崎酸OA处理转染后的细胞,近红外双荧光扫描系统可以检测到KDM3A的磷酸化,初步筛选出4个可能参与KDM3A去磷酸化的磷酸酯酶亚基。结论近红外双荧光系统可以应用于磷酸酯酶的初步筛选。
- 杨昕霆阎海霞沈珝琲张业
- 关键词：磷酸酯酶
