全球变化研究国家重大科学研究计划(2007CB914603)
- 作品数：9 被引量：27H指数：3
- 相关作者：徐小洁王凌雪丁丽华叶棋浓张浩更多>>
- 相关机构：军事医学科学院中国人民解放军总医院第一附属医院重庆医科大学更多>>
- 发文基金：全球变化研究国家重大科学研究计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 敲减人HPIP基因表达抑制细胞生长增殖被引量：3
- 2011年
- 为了探讨人造血相关的PBX相互作用蛋白质基因(HPIP)在肿瘤发生发展中的生物学作用,构建了HPIP小干扰RNA(siRNA)的真核表达载体,验证其敲减效果并观察其对细胞生长增殖的影响.根据人HPIP的cDNA序列,设计了含有小发卡结构的寡核苷酸序列,将其克隆到siRNA表达载体上;将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过实时定量RT-PCR及Western印迹分析检测HPIP基因的表达水平;结晶紫实验及流式细胞技术检测敲减HPIP基因表达对细胞生长和增殖的影响,软琼脂实验检测对肿瘤细胞非锚定依赖性生长的影响.结果显示,构建的siRNA能够有效抑制HPIP基因的表达;结晶紫实验与细胞周期分析实验显示,siRNA介导的HPIP表达沉默导致细胞生长增殖的显著抑制,软琼脂实验结果表明,稳定转染HPIP siRNA能够抑制肿瘤细胞的锚定非依赖性生长.上述结果初步表明,HPIP siRNA能明显抑制肿瘤细胞的生长与增殖,可能是一个潜在的肿瘤治疗新靶点.
- 徐小洁王凌雪范忠义丁丽华张浩杨智洪李杰之叶棋浓
- 关键词：小干扰RNA细胞生长细胞增殖
- 人Egr-1启动子的克隆及其在肿瘤细胞中的辐射诱导反应被引量：3
- 2009年
- 目的:克隆人Egr-1基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测电离辐射对其活性的影响。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出Egr-1启动子,将其克隆到pGL3-basic载体中;将重组质粒转染人肿瘤细胞,测定Egr-1启动子在不同辐射条件下转录活性的改变。结果:成功构建了Egr-1启动子的荧光素酶报告基因;在不同剂量的γ射线照射后,Egr-1的启动子活性均明显高于未照射组;在同一剂量照射后48 h,Egr-1的启动子活性达峰值。结论:本实验构建的Egr-1启动子具有辐射激活的功能,为进一步研究放射-基因治疗奠定了基础。
- 徐小洁丁丽华王凌雪秦玺程龙蒋凯叶棋浓
- 关键词：EGR-1启动子启动子活性
- 人组蛋白H1基因的原核表达、纯化及其活性检测被引量：8
- 2011年
- 目的:克隆人组蛋白H1全长编码区基因,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化以及活性检测。方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人组蛋白H1全长编码区基因,将其克隆到pGEX-KG载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,以SDS-PAGE和Western blot鉴定表达与纯化产物。结果:从人乳腺文库中扩增获得约650 bp的DNA片段,并成功克隆至pGEX-KG载体上,经测序与目的序列完全一致;在Rossate菌中诱导表达出相对分子质量(Mr)约为52 000的目的蛋白,经纯化后获得了纯度较高的重组蛋白GST-H1,激酶实验证明该蛋白活性良好。结论:成功获得了活性良好的重组蛋白GST-H1,为后续研究细胞周期蛋白调控奠定了实验基础。
- 徐小洁范忠义王凌雪张浩丁丽华杜楠叶棋浓
- 关键词：原核表达纯化
- 慢病毒介导RNA干扰HPIP蛋白抑制肿瘤细胞增殖被引量：2
- 2011年
- 目的:建立高效稳定的造血相关的PBX相互作用蛋白质(HPIP)小干扰RNA(siRNA)细胞导入方法,检测HPIP的表达对肿瘤细胞生长增殖的影响。方法:构建人HPIP慢病毒siRNA干扰载体,将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过实时定量RT-PCR及Western印迹分析检测Lenti-H1 HPIP siRNA的干扰效果;将Lenti-H1 HPIPsiRNA与4个包装质粒共同转染293T细胞,包装成慢病毒后,感染宫颈癌HeLa和肝癌HepG2细胞,经嘌呤霉素筛选2周后,收集细胞进行Western印迹检测;用结晶紫实验检测其对肿瘤细胞生长增殖的影响。结果:构建的Lenti-H1 HPIP siRNA能有效抑制HPIP的表达;结晶紫实验显示,慢病毒介导的HPIP siRNA导致细胞增殖的显著抑制。结论:慢病毒介导的HPIP敲减能明显抑制肿瘤细胞的增殖,HPIP可能是一个潜在的肿瘤治疗新靶点。
- 徐小洁范忠义韩永健张浩丁丽华韩聚强王凌雪杨智洪杜楠叶棋浓
- 关键词：RNA干扰慢病毒细胞增殖
- 放射诱导基因FHL2在人群中表达水平的检测被引量：2
- 2009年
- 目的:分析FHL2基因在健康人群个体间表达的差异,评估FHL2作为一种新的辐射生物剂量计的可行性。方法:收集20例健康人血液样本,提取白细胞RNA进行反转录,以β-actin作为内参,利用实时定量PCR方法,检测人群中FHL2基因相对表达水平,并分析其差异。结果:FHL2和β-actin基因的实时定量PCR熔解曲线均为单峰,所得到的Ct值与相应的PCR产物呈良好的线性关系;20例血液标本中FHL2表达水平之间存在较大差异,且其表达水平与性别无关。结论:公认的放射诱导基因FHL2可能不适合作为辐射生物剂量计。
- 王凌雪徐小洁蔺静丁丽华秦玺程龙叶棋浓
- 关键词：基因表达生物剂量计
- 放射诱导基因Gadd45在健康人群中表达水平的检测及其意义被引量：3
- 2009年
- 目的考察Gadd45基因在健康人群个体间表达的差异，评估Gadd45发展成为一种新的辐射生物剂量计的可行性。方法采集20例健康献血员血液样本，提取白细胞RNA进行反转录，以β-actin作为内对照基因，建立实时定量聚合酶链式反应（PCR）方法，并以此方法探讨人群中Gadd45基因表达水平的差异。结果20例受试者血液标本中的Gadd45表达水平之间存在较大差异．且其表达水平与性别无关。结论放射诱导基因Gadd45的表扶可能不适合做牛物剂量计。
- 徐小洁王凌雪蔺静丁丽华王荣福秦玺程龙康磊叶棋浓
- 关键词：生物剂量计基因表达
- 同源重组修复基因RAD51可提高PTEN缺失细胞基因组稳定性被引量：4
- 2011年
- 目的:研究同源重组修复基因RAD51对PTEN缺失小鼠胚胎成纤维细胞基因组稳定性的影响。方法:应用免疫荧光和中性单细胞电泳技术观察PTEN缺失后自发性和辐射诱导DNA双链断裂情况;并构建PTEN缺失细胞稳定转染RAD51的细胞系,γ射线照射后检测细胞存活率。结果:PTEN缺失导致细胞自发性和辐射诱导DNA双链断裂增多;转染RAD51后细胞存活率增高,辐射诱导的DNA双链断裂减少。结论:同源重组修复基因RAD51可以提高PTEN缺失细胞基因组稳定性。
- 陈忠民徐勤枝胡迎春霍艳英周平坤吴德昌
- 关键词：PTENRAD51基因组稳定性
- FOXO3a介导PTEN对DNA修复基因RAD51表达的调节作用
- 2011年
- 目的探讨转录因子FOXO3a在PTEN调节RAD51表达中的作用。方法利用Western印迹技术分析PTEN缺陷与否时,总FOXO3a以及细胞核内FOXO3a磷酸化的情况;转染外源AKT到PTEN野生型细胞或外源PTEN和失去激酶活性的AKT(AKT-DN)到PTEN缺陷型细胞,Western印迹检测核内FOXO3a的磷酸化情况。结果 PTEN缺失导致细胞核内FOXO3a磷酸化水平增高;外源PTEN可以降低PTEN缺陷型细胞核内FOXO3a的磷酸化水平,外源AKT可以增加PTEN野生型细胞核内FOXO3a的磷酸化水平;沉默FOXO3a在一定程度上导致RAD51表达水平下降。结论 FOXO3a可以结合到RAD51基因的启动子区,PI3K/AKT/FOXO3a信号通路是PTEN调节RAD51表达的重要方式之一。
- 陈忠民胡迎春徐勤枝周平坤吴德昌
- 关键词：FOXO3APTENDNA修复DNA断裂RAD51
- PTEN通过抑制PI3K-AKT信号通路上调Rad51基因的表达被引量：5
- 2011年
- 前期研究发现pten缺陷细胞的自发DNA双链断裂损伤水平显著增加.本研究探讨了抑癌基因pten对参与DNA同源重组修复的rad51基因表达的影响和机制.用实时定量PCR技术检测了PTEN野生型和缺陷型细胞rad51的表达水平.结果发现,PTEN缺失会导致rad51的表达降低.PI3K激酶为PTEN的下游负调节靶分子,使用PI3K激酶抑制剂LY294002处理缺陷型细胞后,其rad51表达升高.在PTEN野生型细胞中分别转染Flag-Akt WT(野生型)和Flag-Akt AC(组成型激活),或在PTEN缺陷型细胞中分别转染野生型PTEN和Akt-DN(失去激酶活性的Akt).利用RT-PCR技术检测上述细胞rad51的表达水平,同时利用Western印迹检测上述细胞RAD51蛋白的表达水平.结果发现,转染Flag-Akt WT和Flag-Akt AC后,均能促使PTEN野生型细胞中rad51在mRNA和蛋白水平降低;在PTEN缺陷型细胞中转染野生型PTEN或Akt-DN后,rad51在mRNA和蛋白水平均升高.在PTEN缺陷型细胞中使用siRNA沉默akt后,同样导致RAD51表达升高.结果提示,PTEN可以正向调节RAD51基因表达,PI3K/Akt是其信号通路机制之一.
- 陈忠民胡迎春莫琳霍艳英徐勤枝周平坤吴德昌
- 关键词：PTENRAD51实时定量PCRPI3K/AKT通路
