国家自然科学基金(30270031)
- 作品数：26 被引量：159H指数：7
- 相关作者：薛乐勋王天云王建民柴玉荣侯卫红更多>>
- 相关机构：郑州大学郑州大学第一附属医院河南中医药大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金河南省科技攻关计划国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生农业科学更多>>
- 转基因微藻作为新型生物反应器的研究进展被引量：1
- 2006年
- 转基因微藻作为生物反应器生产生物活性物质已成为基因工程研究的热点之一。目前以转基因微藻作为生物反应器的技术并不十分成熟,然而许多科研人员及生物医药公司将微藻作为新型生物反应器生产有用的外源蛋白。本文对微藻生物反应器构建中的有效核转化方法的建立、转基因微藻中所用的启动子、筛选标记、稳定表达等问题进行了综述,同时介绍了目前转化成功的以及未来可能转化成功的有潜在应用价值的微藻。
- 刘红涛鲁照明侯桂琴李慎柯王建民薛乐勋
- 关键词：生物反应器启动子
- 核基质结合区提高稳定整合的CAT报告基因在NIH3T3细胞中的表达被引量：8
- 2005年
- 通过PCR从人基因组扩增β珠蛋白核基质结合区(matrix attachment region,MAR)及β干扰素MAR,正向及反向克隆至pCAT3载体SV40启动子的上游,分别检测瞬时及稳定表达的情况下MAR在NIH3T3细胞内对CAT报告基因的影响情况。结果显示:瞬时表达情况下,反向及正向插入的MAR均不能提高CAT基因的表达;稳定整合的情况下,插入的β珠蛋白MAR可使CAT报告基因表达水平提高8倍,β干扰素MAR提高3倍,反向及正向插入的MAR没有明显的差别。这表明MAR能在一定程度上提高外源基因的表达水平,并且不同的MAR对外源基因表达的影响存在差异,MAR的插入方向对外源基因的表达水平没有明显的作用。
- 王天云田芳张胜力侯卫红王建民薛乐勋
- 关键词：核基质结合区NIH3T3细胞基因表达基因沉默转基因
- 一种简便高效的改良降落PCR被引量：37
- 2003年
- 降落 (touchdown ,TD)PCR通常涉及 1 5个退火温度 ,程序设计复杂。报道了一种简便高效的改良降落PCR ,只需 5个降落退火温度 ,以杜氏盐藻 (Dunaliellabardawil)基因组为模板 ,设计一对引物扩增胡萝卜素生物合成相关 (carotenebiosynthesisrelated ,cbr)基因的第 3外显子。实验证实该方法程序简单 ,比标准降落PCR步骤简化 70 % ,且产物的特异性及效率都有较大提高。
- 王天云张贵星薛乐勋
- 关键词：PCR降落PCR特异性退火温度聚合酶链反应
- 小鼠canstatin cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达被引量：3
- 2004年
- 目的 :从小鼠肝脏组织克隆canstatincDNA并在大肠杆菌 (E .coli)中表达 ,为进一步研究其抗肿瘤血管生成活性奠定基础。方法 :用Trizol试剂提取小鼠肝脏组织总RNA ,通过RT -PCR扩增小鼠canstatin(mcanstatin)的cDNA ,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将小鼠canstatincDNA定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中 ,在大肠杆菌E .coliBL2 1中经IPTG诱导表达。结果 :小鼠canstatin的cDNA长度为 6 84bp ,编码 2 2 7个氨基酸 ,与已知的人canstatin的cDNA同源性为 89% ,氨基酸的同源性为 96 %。IPTG诱导原核表达载体pET30a(+) /mcanstatin在大肠杆菌E .coliBL2 1中表达。结论 :首次成功克隆了小鼠canstatin的cDNA ,其原核表达载体pET30a(+) /mcanstatin在大肠杆菌E .coliBL2 1中高效表达 ,小鼠canstatin抗肿瘤血管生成活性有待进一步研究。
- 侯卫红袁保梅王天云柴玉荣侯桂琴王建民薛乐勋
- 关键词：CDNA克隆血管生成抑制剂原核表达
- 盐藻肌动蛋白基因启动子驱动的bar基因表达作为核转化筛选标记(英文)被引量：5
- 2005年
- 运用基因组步行方法克隆盐藻肌动蛋白基因 5′上游调控序列,发现相对于ATG上游 -573和 -424b的位置上分别有 75bp长的两个重复序列。没有典型的TATA盒,但有两个TATA样结构、一个CCAAT结构和一个与GCTC(G/C)AAGGC一致的序列。以 700bp的盐藻肌动蛋白基因启动子区序列驱动bar基因的表达作为转化盐藻的筛选标记。转化的藻细胞暗光恢复 24h后,在含 0 5μg/mL除草剂的培养基中常规培养生长 1周,然后将细胞平铺于含 0 5μg/mL除草剂的固体培养基上继续筛选培养。约 20d后从固体培养板上挑选出 5个藻落并作了进一步培养和分析。结果显示, 5个转化藻中携带bar嵌合基因的整合位点均位于核基因组内。Southerblotting分析表明,仅有一个转化藻整合单拷贝的bar基因,而另外 4个转化藻株则包含多个拷贝bar基因片段,提示盐藻核基因转化主要是外源基因的随机整合,外源基因在转化盐藻中的整合拷贝数并不影响其除草剂抗性RT PCR方法证明了bar基因在转化藻中的转录。5个转化藻在含除草剂的液体培养基中维持生长了至少 7个月,表明核基因转化的稳定性。
- 姜国忠吕玉民牛向丽薛乐勋
- 关键词：杜氏盐藻BAR基因
- 重组人纤溶酶原Kringle1-5的制备及其生物学活性被引量：5
- 2005年
- 为了研究重组人纤溶酶原Kringle15(K15)的抗血管生成活性及其对内皮细胞增殖的影响,通过PCR扩增人纤溶酶原K15cDNA,定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达载体pETK15,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,SDSPAGE和Western杂交检测K15的表达。鸡胚尿囊膜(CAM)实验和MTT实验分别检测重组人纤溶酶原Kringle15对鸡胚新生血管生成和内皮细胞的抑制作用。结果表明,IPTG诱导原核表达载体pETK15在E.coliBL21(DE3)中的表达量约占菌体总蛋白量的32%,K15主要以包涵体形式存在,包涵体经过洗涤、溶解、Nispin亲合柱层析纯化以及蛋白质复性等步骤后,获得了纯度约为96%的重组K15蛋白。CAM实验表明,原核表达的重组人K15能有效地按剂量依赖的方式抑制鸡胚新生血管的形成。MTT实验结果显示,重组人K15特异地抑制内皮细胞的增殖,而对非内皮细胞无抑制作用。
- 侯卫红柴玉荣王天云王建民贾岩龙薛乐勋
- 关键词：KRINGLE纤溶酶原肿瘤血管生成抑制剂血管抑素原核表达
- 核基质结合区与转基因沉默被引量：5
- 2004年
- 核基质结合区(matrixattachmentregion,MAR)又叫支架附着区(scafFoldattachmentregion,SAR)是染色质被限制酶消化后仍与核基质或核骨架结合的DNA序列。转基因沉默主要发生在两个水平上,一是转录水平,二是在转录后水平。位置效应是引起转录水平基因沉默的重要因素。研究发现,用MAR构建的载体能够提高转基因的表达水平,能在一定程度上克服基因沉默,降低转基因在不同转基因系间的表达差异,增强外源基因表达的稳定性。
- 王天云袁保梅薛乐勋
- 关键词：核基质结合区转基因沉默转录水平MAR外源基因表达酶消化
- 不同启动子驱动下转基因盐藻外源基因的稳定表达被引量：13
- 2007年
- 为了探讨外源性与内源性启动子对转基因盐藻外源基因表达的影响,利用编码草丁膦乙酰转移酶的bar基因作为筛选标记,将含外源性启动子CMV35S的表达载体CMV35S-bar(G12)和含内源双拷贝碳酸酐酶启动子DCA1的表达载体DCA1-bar(D-B)分别转化盐藻,筛选稳定转化株后,观察在不同启动子驱动下外源基因的表达情况及对转基因盐藻生长的影响。通过电击法分别将表达载体G12和D-B转化盐藻,经草丁膦(PPT)筛选后,各得到了3株PPT抗性藻株,经PCR及测序分析证实外源基因bar已经整合到盐藻的基因组中,半定量RT-PCR结果显示,在内源性启动子DCA1驱动下,bar基因的表达强度明显高于在外源性启动子驱动下bar的表达,并且D-B转化株的bar基因表达在盐诱导下其表达明显提高,而G12转化株中bar基因的表达对盐诱导无反应。Southern blot分析显示,外源基因的拷贝数与不同启动子间无相关性。转化株的生长特性分析显示,D-B转化株的生长速度明显高于G12转化株。结果表明,内源诱导型启动子在驱动转基因盐藻外源基因的高效稳定表达中比外源组成型启动子更具有优势。
- 李杰曲东京刘玲玲冯书营薛乐勋
- 关键词：启动子
- 重组小鼠canstatin N端片段对鸡胚新生血管生成的抑制作用(英文)被引量：2
- 2004年
- 为了研究重组小鼠canstatinN端片段的体内抗血管生成活性 ,通过PCR扩增小鼠canstatinN端片段cDNA ,定向克隆于原核表达载体 pET30a (+)中 ,构建小鼠canstatinN端片段重组表达载体 pET mCanN ,转化E .coliBL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和蛋白质印迹检测小鼠canstatinN端片段的表达 .结果表明 ,IPTG诱导原核表达载体 pET mCanN在大肠杆菌E .coliBL2 1(DE3)中高效表达 ,小鼠canstatinN端片段表达量约占菌体总蛋白量的 18% ,小鼠canstatinN端片段主要以包涵体形式存在 ,包涵体经过洗涤、裂解、Ni spincolumn亲合柱层析以及蛋白质复性等步骤纯化后 ,获得了纯度约为 92 %的重组小鼠canstatinN端片段 .鸡胚绒毛尿囊膜 (chickenembryochoriollantoicmembrane ,CAM)实验表明 ,原核表达的小鼠canstatinN端片段能有效地按剂量依赖的方式抑制鸡胚新生血管的形成 .
- 侯卫红贾岩龙王天云柴玉荣袁保梅田芳王建民薛乐勋
- 关键词：CANSTATIN肿瘤血管生成抑制剂原核表达
- 人β-珠蛋白MAR对转基因在不同细胞中表达的影响被引量：10
- 2005年
- 目的:研究人β珠蛋白核基质结合区(matrixattachmentregion,MAR)在不同表达宿主中对转基因表达的影响.方法:通过PCR从人基因组扩增β珠蛋白MAR,正向克隆至pCAT3control载体SV40启动子的上游,分别检测在瞬时及稳定表达的情况下,MAR在NIH3T3及Hela细胞中对CAT报告基因的影响情况.结果:在瞬时表达情况下,NIH3T3细胞及Hela细胞中MAR均不能提高CAT基因的表达;在稳定整合的情况下,NIH3T3细胞中β珠蛋白MAR可使CAT报告基因表达水平提高8倍,而在Hela细胞表达水平只提高2.5倍.结论:MAR能在一定程度上提高稳定外源基因的表达水平;MAR的作用与表达宿主相关.
- 余惠明王天云
- 关键词：核基质结合区基因沉默
