国家自然科学基金(30800830)
- 作品数：7 被引量：8H指数：2
- 相关作者：曲连东姜骞刘家森郭东春林欢更多>>
- 相关机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所黑龙江八一农垦大学更多>>
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- 兔出血症病毒衣壳蛋白VP60与兔肝脏细胞中相互作用蛋白的初步筛选被引量：2
- 2011年
- 为鉴定兔出血症病毒(RHDV)在感染兔肝脏过程中与肝细胞膜表面相互作用的靶蛋白,本研究利用SMART文库构建技术构建了兔肝脏细胞的真核表达cDNA重组质粒文库,将其转染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选表达兔肝细胞蛋白的阳性SP2/0细胞。以RHDV-VP60蛋白作为固相包被抗原,经筛选,获得能够与VP60蛋白相互结合的表达性阳性SP2/0细胞克隆。测序表明26个克隆与兔的一些功能性蛋白有较高的同源性,其中包括代谢酶类13个、免疫信号通路受体蛋白5个以及其他细胞膜蛋白等。本研究鉴定的与RHDVVP60具有结合性的细胞蛋白为RHDV感染机制的研究奠定了基础。
- 穆亚芳刘家森郭东春李茂中原冬伟姜骞林欢曲连东
- 关键词：兔出血症病毒文库构建
- 兔肝cDNA文库的构建
- 本研究分离纯化3月龄新西兰白兔肝组织总RNA,构建以真核表达载体pGADT7-Rec为载体的酵母cDNA文库,文库容量为2.55×10个转化子/μg质粒,文库滴度为2.7×10cfu/mL,文库插入片段大小约为0.5 k...
- 熊梅穆亚芳刘家森原东伟郭东春姜骞林欢曲连东
- 关键词：肝脏CDNA文库EST
- 与兔出血症病毒VP60蛋白相互作用蛋白的初步鉴定被引量：2
- 2010年
- 为获得与兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)相互作用的细胞蛋白,本研究以pMD-VP60重组质粒为模板扩增RHDV的VP60基因,克隆于表达载体pGEX-6p-1中,构建了重组表达质粒pGEX-VP60,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达GST重组蛋白(rVP60),western blot分析表明该蛋白具有与VP60单克隆抗体(MAb)良好的反应原性。以亲和层析纯化的rVP60进行pull-down实验,从兔的肝脏细胞膜蛋白中获得与VP60相互作用的蛋白,多肽质量指纹图谱分析表明,其相互作用的蛋白为ATP合成酶β亚基,提示该蛋白可能与RHDV的感染相关。
- 熊梅穆亚芳刘家森郭东春原冬伟姜骞林欢曲连东
- 关键词：兔出血症病毒VP60蛋白ATP合成酶
- 兔出血症病毒肝脏表面蛋白受体的初步筛选
- 2015年
- 为了筛选鉴定兔出血症病毒（RHDV）感染的肝脏细胞表面受体，取成年兔肝脏组织以胰酶消化，经300目铜网过滤，得到完整的兔肝脏细胞。用生物素对细胞表面蛋白进行标记和分离；采用病毒铺覆蛋白技术分析兔肝脏细胞表面蛋白。结果表明，在130000-170000的位置上存在与RHDV相互作用的特异性蛋白条带；利用液相色谱联合质谱技术（LCMS／MS）对特异蛋白条带进行shotgun分析，鉴定得到38个候选蛋白，其中3种蛋白在已知病毒感染过程中具有重要作用。
- 陈淑慧刘家森黄艳秋单丽玲郭东春姜骞李志杰崔玉东曲连东
- 关键词：兔出血症病毒肝脏细胞表面蛋白
- 兔肝组织cDNA文库的构建及表达序列标签分析
- 2010年
- 分离纯化了3月龄新西兰白兔肝组织总RNA,构建了以真核表达质粒pGADT7-Rec为载体的酵母cDNA文库,该文库的库容量为2.55×106转化子/μg质粒,文库的效价为2.7×109CFU/mL,PCR分析结果表明文库插入片段大小为0.5～2.0kb,重组率约为100%。对随机挑选的50个克隆进行的测序结果表明,37个EST片段与日本大耳白兔基因有较高的同源性,11个EST片段与其他种属哺乳动物功能基因有较高的同源性,另有2个EST片段为未知基因。所构建的兔肝组织cDNA文库符合要求,为进一步研究兔肝组织的功能基因奠定了基础。
- 熊梅穆亚芳刘家森原冬伟郭东春姜骞林欢曲连东
- 关键词：CDNA文库表达序列标签
- ELISA验证兔铁蛋白重链与RHDV VP60相互作用
- 2013年
- 为验证本实验室前期实验中初步鉴定的兔铁蛋白重链(FTH)与兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)具有相互作用关系,本研究采用RT-PCR技术从兔肝脏扩增编码FTH基因,并将其克隆至pET-32a(+)中转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达。重组FTH蛋白(rFTH)经IPTG诱导获得表达,采用Ni-NTA Agarose纯化rFTH。利用纯化的VP60作为ELISA包被抗原检测FTH与VP60的相互作用。结果表明,ELISA检测的OD490nm值与FTH蛋白量呈正相关。本研究进一步验证了FTH与VP60具有相互作用关系。
- 孙宏勇刘家森王泽祥陈淑慧单丽玲郭冬春姜骞林欢曲连东
- 关键词：兔出血症病毒VP60ELISA
- 表达兔出血症病毒VP60蛋白重组牛疱疹病毒1型的构建及免疫原性分析被引量：2
- 2014年
- 为制备表达兔出血症病毒(RHDV)VP60蛋白的重组病毒疫苗,本研究将RHDV VP60基因插入到CMV启动子下,构建牛疱疹病毒1型(BoHV-1)gE基因缺失转移载体,利用磷酸钙介导转染法将该转移载体与gE基因缺失的亲本病毒基因组DNA共转染牛肺细胞,制备了表达RHDV VP60基因的重组BoHV-1(rBoHV-1/gE-/VP60)。通过PCR、western blot及间接免疫荧光鉴定表明VP60基因在rBoHV-1/gE-/VP60中获得表达。并且体内试验表明重组病毒能够有效诱导小鼠产生RHDV特异性抗体。本研究构建了表达RHDV VP60基因的rBoHV-1/gE-/VP60,为研制预防兔出血症的BoHV-1活载体疫苗奠定了基础。
- 黄艳秋原冬伟刘行波刘家森陈淑慧单丽玲郭东春姜骞崔玉东薛飞曲连东
- 关键词：兔出血症病毒VP60基因
- 汉坦病毒L基因的分段克隆及原核表达被引量：2
- 2012年
- 为原核表达汉坦病毒(HV)L蛋白,本研究根据HV 76-118株全长L基因序列分段设计合成了6对引物。通过RT-PCR方法分段扩增L基因的6个片段,分别克隆于原核表达载体pET-30a中,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。SDS-PAGE分析表明,获得与预期分子量一致的特异的目的蛋白。Western blot检测表明,重组蛋白与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性反应。
- 李茂中刘家森郭东春姜骞林欢曲连东
- 关键词：汉坦病毒原核表达
