艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治专项(2009ZX10004-710)
- 作品数：9 被引量：20H指数：2
- 相关作者：姚立红陈爱珺郭建强张智清刘晓宇更多>>
- 相关机构：中国疾病预防控制中心青岛农业大学四川农业大学更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- H5N1亚型流感病毒M2与NA基因真核表达载体的构建与鉴定
- 2011年
- 目的 构建表达H5N1亚型流感病毒M2和NA基因的多种真核表达载体.方法 以我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒（A/Anhui/1/2005）作为研究对象,PCR扩增全长M2与NA基因.将M2基因克隆入真核表达载体pStar的IRES上游或下游的MCS,构建重组pStar-M2/和pStar-/M2.将NA基因克隆人pStar载体IRES上游或下游的MCS,构建重组pStar-NA/和pStar-/NA.将M2和NA基因先后克隆到pStar载体IRES序列的上游和下游MCS,分别构建双基因共表达重组pStar-M2/NA和pStar-NA/M2.将重组质粒转染293细胞,使用IFA方法 检测各重组质粒相应外源基因的表达.结果 通过酶切鉴定,各重组质粒构建正确.将其转染293细胞后,使用IFA方法 检测到了各重组质粒中相应外源基因的表达.结论 构建了多种表达H5NI亚型流感病毒M2和（或）NA基因的真核表达载体,为研究开发流感DNA疫苗奠定了基础.
- 郭建强姚立红陈爱珺刘晓宇付金奇徐鹏卫张智清
- 关键词：流感病毒A型病毒蛋白质类神经氨酸酶
- H1N1亚型流感病毒NA基因在昆虫杆状病毒系统中的表达及鉴定
- 2013年
- 目的构建含有H1N1亚型流感病毒NA基因的重组杆状病毒。方法用PCR方法扩增甲型H1N1亚型流感病毒（A／PR8／34）全长神经氨酸酶基因，并将其连接于pFastBacdual载体，构建杆状病毒转移载体pFBD-NA。转化含有Bacmld的DHl0B感受态细胞后，获得重组穿梭载体rBacmid—NA。将其转染昆虫细胞sf9，获得重组病毒rBac—NA。提取重组杆状病毒rBac—NA的DNA并使用PCR方法检测；采用间接免疫荧光，SDS-PAGE，WesternBlot鉴定以及ELISA方法检测所表达的NA蛋白。结果经PCR鉴定所构建质粒rBacmid—NA正确；使用间接免疫荧光检测可见特异性绿色荧光位于感染细胞的表面，WesternBolt检测可与小鼠抗PR8株多克隆抗体和兔抗甲型流感病毒NA多克隆抗体发生特异性免疫反应；经ELISA检测，NA蛋白可被鼠抗流感病毒（PR8）多克隆抗体特异性识别。结论上述结果证明，我们获得了表达流感病毒NA蛋白的重组杆状病毒，为进一步研究NA蛋白的功能和新型流感疫苗的开发奠定了基础。
- 姚立红付金奇陈爱珺刘晓宇徐鹏卫郭建强张乐翠
- 关键词：正黏病毒科神经氨酸酶
- 可调控表达甲型流感病毒M2蛋白的哺乳动物细胞系的建立与鉴定被引量：5
- 2011年
- 甲型流感病毒M2蛋白是一种具有离子通道功能的跨膜蛋白,其氨基酸序列非常保守,可用于流感通用疫苗的研究。为了构建可调控的稳定表达甲型流感病毒M2蛋白的哺乳动物细胞系,首先应用PCR方法从含有流感病毒PR8株第七节段全长基因的质粒中扩增得到M2基因。将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA5/FRT/TO上,用BamHⅠ和NotⅠ双酶切鉴定正确后将重组质粒与表达Flp重组酶的pOG44质粒共转染Flp-In T-REx-293细胞,使目的基因整合到宿主细胞染色体。筛选具有Hygromycin B抗性的细胞株。在该细胞的培养基中加入四环素以诱导目的基因表达,48 h后通过间接免疫荧光方法检测到M2蛋白的表达。共得到16株高表达M2蛋白的重组细胞株,这些细胞株在传10代后仍能稳定表达目的蛋白。未加四环素诱导的细胞没有检测到M2蛋白,说明四环素调控系统严格控制着目的基因的表达。今后,该细胞系可用于流感病毒M2蛋白的功能研究、流感候选疫苗的免疫学评价以及流感病毒减毒活疫苗的研制。
- 刘晓宇郭建强姚立红陈爱珺付金奇张智清
- 关键词：甲型流感病毒四环素
- 共表达甲型流感病毒M1和HA抗原的重组杆状病毒的构建被引量：2
- 2012年
- 为构建同时表达流感病毒M1和HA抗原的重组杆状病毒,采用PCR扩增流感病毒A/PR/8/34株的M1基因和去除信号肽的HA基因,将两基因克隆到杆状病毒转座载体pFastBac Dual的两个启动子下游的多克隆位点,筛选出阳性重组转座载体pFastBac Dual-M1-HA。将其转化含有杆状病毒穿梭载体(Bacmid)的DH10Bac感受态细胞,通过抗生素、蓝白斑筛选和PCR鉴定获得重组杆状病毒穿梭载体rBacmid-M1-HA,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-M1-HA。提取重组病毒基因组,通过PCR鉴定外源基因插入成功。间接免疫荧光和Western-blot检测表明,该重组杆状病毒在Sf9昆虫细胞中成功地表达了M1和HA。应用杆状病毒/昆虫细胞系统成功共表达流感病毒M1和HA抗原,为研究流感病毒VLP的形成机制和开发新型流感疫苗奠定了基础。
- 徐鹏卫郭建强姚立红陈爱珺刘晓宇曾宪垠张智清
- 关键词：流感病毒血凝素共表达杆状病毒表达系统
- 铜绿假单胞菌外毒素A基因突变体的构建及其在大肠埃希菌中的表达被引量：1
- 2014年
- 目的将铜绿假单胞菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,PEA)基因突变为无毒性的ntPE基因,并在大肠埃希菌中进行表达。方法利用Primer Premier 5.0软件设计PEA基因引物及PEA基因第553位氨基酸缺失的突变引物,以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)基因组DNA为模板,PCR扩增PEA基因,插入pGEM-T载体中,构建重组克隆质粒pGEM-PEA,以其为模板,利用突变引物,扩增ntPE基因(无毒性PEA),插入pET-30a载体中,构建原核表达质粒pET-ntPE,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析。结果测序结果证明已成功获得突变基因;原核表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约69 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30%,可被小鼠抗PEA单克隆抗体特异性识别,具有较好的抗原性。结论已成功获得无毒性的PEA突变基因,为构建以PEA为蛋白佐剂的融合蛋白疫苗奠定了基础。
- 姚立红徐一陈爱珺郭建强薄洪尉玉杰张智清
- 关键词：铜绿假单胞菌外毒素基因突变体原核细胞
- 甲型流感病毒血凝素基因在昆虫杆状病毒系统中的表达被引量：7
- 2011年
- 目的利用昆虫杆状病毒系统表达甲型流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白。方法 PCR扩增去除信号肽的甲型H1N1(A/PR/8/34)流感病毒HA基因,与pFastBacdual载体(pFBd)连接,构建转移载体pFBd-HA,转化含Bacmid的DH10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒rBacmid-HA。rBacmid-HA转染sf9昆虫细胞,获得重组病毒rBac-HA。采用噬斑形成法检测病毒滴度,PCR法检测重组杆状病毒基因组HA基因,间接免疫荧光法、Western blot法和ELISA法检测HA蛋白的表达。结果穿梭质粒rBacmid-HA经PCR鉴定构建正确;第3代rBac-HA的滴度为3×107 pfu/ml;感染rBac-HA的sf9细胞经PCR扩增可见4 216 bp的特异性条带,间接免疫荧光检测可见绿色荧光,Western blot鉴定与鼠抗甲型流感病毒HA(H1)单抗和鸡抗流感病毒(California株)多抗发生特异性反应,ELISA检测与鼠抗流感病毒(PR8株)多抗特异性结合的能力强于与鸡抗流感病毒(California株)多抗结合的能力。结论 利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达了甲型流感病毒HA蛋白。
- 付金奇郭建强姚立红陈爱珺刘晓宇张乐萃张智清
- 关键词：杆状病毒SF9细胞
- 甲型H5N1流感病毒M2与HA双基因载体疫苗在小鼠体内的免疫学评价被引量：2
- 2010年
- 高致病性H5N1亚型禽流感病毒(AIV)严重威胁到人类健康,因此研制高效、安全的禽流感疫苗具有重要意义。以我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)作为研究对象,PCR扩增基质蛋白2(M2)和血凝素(HA)基因全长开放阅读框片段,构建共表达H5N1亚型AIV膜蛋白基因M2和HA的重组质粒pStar-M2/HA。此外,还通过同源重组以293细胞包装出表达M2基因的重组腺病毒Ad-M2以及表达HA基因的重组腺病毒Ad-HA。用间接免疫荧光(IFA)方法检测到了各载体上插入基因的表达。按初免-加强程序分别用重组质粒pStar-M2/HA和重组腺病毒Ad-HA+Ad-M2免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,每次间隔14d。第1、3次用DNA疫苗,第2、4次用重组腺病毒载体疫苗,每次免疫前及末次免疫后14d采集血清用于检测体液免疫应答,末次免疫后14d采集脾淋巴细胞用于检测细胞免疫应答。血凝抑制(HI)实验检测到免疫后小鼠血清中的HI活性。ELISA实验检测到免疫后小鼠血清中抗H5N1亚型流感病毒表面蛋白的IgG抗体。ELISPOT实验检测到免疫后小鼠针对M2蛋白和HA蛋白的特异性细胞免疫应答。流感病毒M2与HA双基因共免疫的研究,为研究开发新型重组流感疫苗奠定了基础。
- 郭建强姚立红陈爱珺徐一刘晓宇舒跃龙张智清
- 关键词：血凝素联合免疫
- 甲型流感病毒分支状M2e多肽疫苗不同途径免疫效果的研究被引量：1
- 2015年
- 目的 比较甲型流感病毒分支状多肽疫苗最佳免疫途径.方法 通过化学方法合成（M2e） 4-tuftsin,与Al（OH）3佐剂混合,肌注途径免疫小鼠;与JY佐剂混合,滴鼻免疫小鼠,观察两种途径的免疫效果.结果 肌内注射免疫途径诱导产生抗体的能力高于滴鼻免疫,（M2e） 4-tuftsin滴鼻免疫诱导细胞免疫的能力最强,（M2e）4-tuftsin通过肌肉注射和滴鼻免疫途径均对小鼠有一定的保护效果,但肌注免疫效果最好.结论 分支状M2e多肽肌内注射比滴鼻免疫保护效果好。
- 姚立红刘晓宇杨琦陈爱珺郭建强张智清
- 关键词：肽类流感病毒A型
- 稳定表达甲型流感病毒血凝素蛋白的哺乳动物细胞系的建立被引量：2
- 2011年
- 目的建立稳定表达甲型流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白的哺乳动物细胞系。方法 PCR扩增流感病毒(A/PR/8/34)全长HA基因,并将其克隆入真核表达载体pcDNA5/FRT(pDF)中,构建重组表达质粒pDF-HA,将其与表达Flp重组酶的pOG44质粒共转染Flp-In-CHO细胞,通过体内同源重组使目的基因整合至宿主细胞染色体上。采用Hygromycin B持续压力筛选重组细胞系CHO-HA,通过间接免疫荧光法(IFA)和Western blot法检测HA蛋白的表达。重组细胞连续培养10代后,采用PCR和IFA法检测细胞中HA的基因遗传和蛋白表达的稳定性。结果重组表达质粒pDF-HA经双酶切及测序,证实构建正确;通过Hygromycin B抗性及IFA,共筛选出20株高表达HA蛋白的重组细胞株,Western blot结果进一步证实,HA蛋白在重组细胞中获得表达,并被切割成HA1和HA2蛋白;连续培养10代后,PCR与IFA方法分别检测到重组细胞HA基因和蛋白的表达。结论已成功建立了稳定表达甲型流感病毒HA蛋白的哺乳动物细胞系,为针对HA蛋白和流感病毒的免疫学检测以及HA蛋白的功能研究提供了靶细胞。
- 郭建强陈爱珺姚立红刘晓宇付金奇徐鹏卫张智清
- 关键词：哺乳动物细胞
